11

Заняття 8

„ ЕЛЕКТРОФОРЕЗ БІЛКІВ

У полікриламідному гелі ” План:

1. Засвоїти теоретичні основи електрофорезу. Огляд електрофорез у поліакриламідному гелі для поділу білків і пептидів.

2. Вміти готувати необхідних розчинів і полімеризація поліакриламідних гелів.

3. Складати апарат для проведення електрофорезу білків у ПААГ. Вміти готувати й наносити зразки. Проводити електрофорез. Фіксувати й фарбувати гель.

4. Вести документування гелю й аналіз результатів.

Мета роботи: Провести електрофоретичне розділення у поліакриламідному гелі запасних білків насіння льону олійного різних генотипів та встановити мажорні та мінорні компоненти у різних білкових фракціях: альбумінів, глобулінів, проламінів.

Знати та вміти:

1. Електрофорез як метод поділу біологічних макромолекул.

2. Види електрофорезу, їхнє порівняння, переваги й недоліки.

3. Використання електрофорезу в поліакриламідному гелі для поділу молекул білків і пептидів відповідно до їхньої молекулярної маси.

4. Аналіз результатів, які були отримані в результаті виконання практичної частини (визначення гомогенності білкових препаратів і молекулярних мас білків, що входять в аналізований препарат).

Устаткування:

1. Вертикальна камера для електрофорезу з комплектуючими;

2. блок живлення з регулюванням сили току або/і напруги;

3. Система гель-документування;

4. Холодильник (+4°), з морозильною камерою (-20°) для зберігання розчинів*;

5. Електронні аналітичні ваги* і набір шпателів для зважування;

6. Мірні циліндри (100 і 500 мол), мірні скляні склянки.

7. Скляні бутлі для зберігання розчинів.

8. Один комплект піпеток-дозаторів (10, 200 і 1000 мкл)*;

9. Пробірки конусні (15 і 50 мол), пробірки типу епендорф (0,5 і 1,5 мол)

10. Накінечники для піпеток (20, 200, 1000, 5000 мкл)*.

Реактиви:

1. Акриламід,

2. N,N' -метиленбісакриламід,

3. Трис,

4. Додецилсульфат натрію (SDS),

5. Персульфат амонію,

6. N,N,N',N' -тетраметилетилендиамін (ТЕМЕД),

7. Гліцин,

8. β-меркаптоетанол,

9. ЭДТА,

10. Бромфеноловий синій,

11. Кумасі R- 250,

12. Оцтова кислота,

13. Набір маркерів молекулярних мас білків (1-150 кДа)

1. Теоретична частина

1. Основи електрофорезу

Електрофорез - це переміщення заряджених часток у розчині (залежно від знака їх сумарного електричного заряду) до анода або катода під дією електричного поля. Оскільки швидкість руху молекул в електричному полі залежить від їх заряду, форми й розміру, то електрофорез може бути використаний для їхнього поділу.

1.1.1 Принцип електрофоретичного розділення

Макромолекули, що перебувають у буферному розчині, мають деякий сумарний електричний заряд, величина й знак якого залежать в основному від РН середовища. Якщо через цей розчин почати пропускати електричний струм, то під дією електричного поля макромолекули у відповідності зі своїм сумарним зарядом мігрують у напрямку катода або анода, причому їх тертя про навколишнє середовище обмежує швидкість міграції. Залежно від величини заряду й розмірів макромолекули набувають різні швидкості, і в цьому - сутність процесу електрофорезу.

Поступово вихідний препарат, що складався з різних молекул, розділяється на зони однакових молекул мігруючих з однією й тією ж швидкістю. Однак у рідині не можна уникнути конвекції, яка деформує й змішує зони, що розділяються, тому звичайно електрофорез проводять у гелеподібному середовищі.

Наявність сітки гелю приводить до того, що макромолекули, які розділяють, зустрічаються з нитками полімеру, що утворює сітку гелю, яка збільшує ефективне тертя о середовище, а отже, знижує швидкість руху молекул. Очевидно, що перешкоди для міграції стають особливо серйозними, якщо середній діаметр просторових гнізд гелю виявляється рівним з розмірами макромолекул. У цьому випадку вирішальний вплив на електрофоретичну рухливість різних молекул має співвідношення їхніх лінійних розмірів.