1.1.2 Умови електрофоретичного розділення

Електрофорез дозволяє розділяти макромолекули, що різняться за такими найважливішими параметрами, як:

• розміри (або молекулярна маса),

• просторова конфігурація,

• вторинна структура

• електричний заряд,

причому ці параметри можуть виступати як порізно, так і в сукупності.

Біологічні макромолекули - білки, нуклеїнові кислоти, полісахариди й ін. - перебувають у водному розчині у вигляді часток, що несуть певний електричний заряд. Заряд макромолекули визначається вхідними до її складу групами, здатними до електролітичної дисоціації. Ступінь дисоціації груп залежить від багатьох факторів, зокрема, від рН середовища. Загальний заряд біологічної макромолекули також може змінюватися при її взаємодії з іонами або іншими молекулами.

1.1.3 Застосування методу електрофорезу

Найчастіше метод електрофорезу застосовують для аналізу й очищення білків і нуклеїнових кислот, хоча цей метод може бути використаний і для інших заряджених біологічних молекул, таких як вуглеводи, амінокислоти, пептиди, нуклеотиди тощо.

Для фракціонування білків, нуклеїнових кислот і їх фрагментів також використовують майже винятково гель-електрофорез. Найбільше широко використовуються поліакриламідні (ПААГ) гелі й гелі агарози.

Варіюючи концентрацію полімеру, можна отримувати гелі з дуже широким діапазоном розмірів пор. Крім того, можна змінювати електричні заряди макромолекул шляхом варіації рН буферного розчину, а їх конфігурацію шляхом введення в буфер денатуруючих агентів або детергентів. У якості інших «носіїв» рідкої фази широко використовують плівки з ацетату целюлози, фільтрувальний папір, тонкі шари силікагелю, целюлози, сефадексу й ін. У деяких випадках, наприклад для поділу низькомолекулярних речовин, ці системи мають свої переваги.

1.2 Види електрофорезу

Нижче наведені різні види електрофорезу з їхнім коротким описом.

Електрофорез із рухливою границею проводиться в U-образній кюветі із прямокутним поперечним перерізом. Метод розроблений для поділу білків у буфері. Основний недолік методу - наявність конвекційних потоків рідини під час проведення електрофорезу.

Зональний електрофорез у вільному середовищі виключає конвекційні потоки за рахунок обертання електрофоретичної трубки або за рахунок проведення електрофорезу в тонкому шарі рідини.

Зональний електрофорез у градієнті щільності розроблений для стабілізації білкових зон за рахунок проведення електрофорезу в градієнті щільності сахарози, гліцерину, етиленгліколю, важкої води тощо.

Зональний електрофорез у підтримуючім середовищі з капілярною структурою

полягає в тому, що для стабілізації білкових зон у середовище, де проводиться поділ, вносяться речовини, що утворюють капілярну структуру (фільтрувальний папір, плівки з ацетату целюлози, стовпчики або блоки целюлозного порошку, гранульований крохмаль, агарові, агарозні, крохмальні або поліакриламідні гелі).

Електрофорез на фільтрувальному папері проводиться в підтримуючім середовищі, у якості якої служать смужки фільтрувального паперу.

Електрофорез на ацетаті целюлози використовує у якості підтримуючого середовища смужки ацетату целюлози.

Електрофорез у колонках і блоках гранульованого підтримуючого середовища

застосовується в основному для препаративного поділу білкових сумішей. У якості підтримуючого середовища використовуються порошки зі скла або пластмаси (полівінілхлориду), гранульований крохмаль, целюлозний порошок, а також сефадекс або агароза, приготовлені у вигляді стовпчиків або блоків.

Електрофорез в агаровому й агарозному гелях використовує у якості підтримуючого середовища названі вище пористі гелі.

Електрофорез у крохмальних гелях використовує у якості підтримуючого середовища картопляний і рисовий крохмаль.

Електрофорез у поліакриламідному гелі (ПААГ) - найбільш використовуваний вид аналітичного й препаративного електрофорезу. Цей метод використовує як підтримуюче середовище співполімер акриламіду й бісакриламіду.

Ізоелектричне фокусування - один з новітніх методів поділу макромолекул. Під час ізоелектричного фокусування між анодом і катодом створюється градієнт рН. Заряджені молекули, які спочатку рівномірно розподілені в середовищі або внесені в це середовище у вигляді однієї смуги, рухаються відповідно до їхнього фактичного заряду в напрямку протилежно зарядженого електрода. Якщо ці молекули амфотерні, тобто містять групи, здатні нести різний електричний заряд, залежно від навколишнього рН, то при переміщенні в градієнті штучно сформованого рН їх сумарний заряд буде безупинно змінюватися доти, доки вони не досягнуть положення, де він стане рівним нулю. Це відбувається в тому місці градієнта рН. де значення рН буде дорівнювати ізоэлектричній точці молекули. Таким чином, молекули, що мають однакову ізоелектричну точку, сконцентруються у вузькій зоні. Якщо штучно сформований градієнт рН стабільний, то подальших змін відбуватися не буде й молекули залишаться сконцентрованими, оскільки їх дифузії перешкоджає електричне поле.

Ізотахофорез - тип електрофорезу, при якому усі заряджені макромолекули рухаються в електричному полі з однаковими (ізо) швидкостями (тахо).