Общий экспериментальный подход, используемый в биохимии

Этот подход состоит из трех составных частей: 1) выделение биомолекул и органелл, находящихся в клетке (см. предыдущий раздел о субклеточном фракционировании); 2) определение структуры биомолекул; 3) использование различных препаратов для анализа функций биомолекул и их метаболизма (т.е. процессов синтеза и распада).

1. Выделение биомолекул. Как и в случае органелл, для выяснения функции любой биомолекулы необходимо прежде всего получить ее в чистом виде. В табл. 2.5 перечислены основные методы, используемые для разделения и очистки биомолекул. Здесь мы не будем подробно обсуждать их: некоторые из них будут вкратце описаны в других частях книги.

Таблица 2.5. Основные методы разделения и очистки биомолекул. Большая часть этих методов пригодна для анализа компонентов, находящихся в клеточных экстрактах и других биохимических препаратах. Для получения большинства биомолекул в чистом виде, как правило, необходимо последовательно использовать несколько методов. Подробности о применении каждого из методов читатель может найти в соответствующих руководствах

Фракционирование солями (например, осаждение с сульфатом аммония)

Хроматографня

Бумажная

Ионообменная (анионо- и катионообменная)

Аффинная

Тонкослойная

Газо-жидкостная

Жидкостная под высоким давлением

Гель-фильтрация

Электрофорез

На бумаге

Высоковольтный

В агарозе

В ацетатцеллюлозе

В крахмальном геле

В полиакриламиде

В полиакриламиде в присутствии додецилсульфата натрия

Ультрацентрифугирование

Почти всегда очистить биомолекулы до состояния гомогенности (т. е. до отсутствия загрязнения любыми другими биомолекулами) удается лишь при последовательном применении нескольких таких методов.

Важно иметь в виду, что прогресс в биохимии зависит от разработки новых методов анализа, очистки и определения структуры. Например, в области биохимии липидов произошел настоящий переворот после введения в практику газо-жидкостной и тонкослойной хроматографии. Анализ мембранных и многих других белков был крайне затруднен до тех пор, пока не появился метод электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН-ПЭГ): применение додецилсульфата натрия приводит к “солюбилизации” (растворению) ряда белков, которые ранее не удавалось перевести в растворимое состояние. После такой солюбилизации уже можно проводить электрофорез. Разработка методов клонирования и секвенирования (определения последовательности мономеров) ДНК произвела подлинную революцию в изучении нуклеиновых кислот и вообще в биологии.

2. Определение структуры биомолекул. После очистки биомолекул можно определить их структуру. Это—совершенно необходимое условие успешного детального изучения корреляции между структурой и функцией. Основные методы, используемые для анализа структуры биомолекул, перечислены в табл. 2.6.

Таблица 2.6. Основные методы определения структуры биомолекул

Элементный анализ

Спектроскопия в Уф-, видимой и инфракрасной областях, ЯМР-спектроскопия

Использование кислотного или щелочного гидролиза для расщепления изучаемых молекул на составляющие компоненты

Использование набора ферментов с известной специфичностью для расщепления изучаемых молекул (например, использование протеаз, нуклеаз, гликозидаз)

Масс-спектрометрия

Специфические методы секвенирования (например, белков или нуклеиновых кислот)

Рентгеновская кристаллография

Они должны быть знакомы читателям, изучавшим органическую химию. Специфичность действия ряда ферментов позволяет использовать их в качестве мощных инструментов для выяснения структурных особенностей некоторых биомолекул. Теоретический и технический прогресс, позволивший повысить разрешающую способность масс-спектрометрии и ЯМР-спектроскопии, способствовал тому, что эти методы стали широко использоваться для определения структуры молекул. Например, крайне сложную структуру углеводных цепей, входящих в состав некоторых биомолекул, в частности гликопротеинов, во многих случаях удалось установить с помощью ЯМР-спектроскопии высокого разрешения. Наиболее детальную информацию о структуре биомолекул дают методы рентгеновской кристаллографии. Именно благодаря их использованию была установлена детальная структура различных белков и ферментов, а также открыта двойная спираль ДНК.

3. Изучение функций и метаболизма биомолекул с использованием различных препаратов. Первые биохимические исследования человека и животных проводились на уровне целого организма. В качестве примера можно привести изучение дыхания и судьбы поступающих в организм соединений. Вскоре стало ясно, однако, что целый организм слишком сложен, чтобы можно было получить четкие ответы на различные вопросы. Многие проблемы, возникавшие при работе на целом организме, были устранены после приготовления более простых препаратов и изучения их in vitro. В табл. 2.7 приведены различные типы препаратов, которые используются в настоящее время для изучения биохимических процессов; большинство сведений, содержащихся в этой книге, получено именно на таких препаратах. В таблице препараты перечислены в порядке уменьшения их сложности. Однако использование более простых препаратов тоже имеет свои ограничения. Результаты экспериментов in vitro могут оказаться ошибочными, например в том случае, когда при гомогенизации клеток высвобождаются ферменты, частично разрушающие исследуемые соединения.

Таблица 2.7. Иерархическая последовательность препаратов, используемых для изучения биохимических процессов

Метод	Комментарии
Исследования на уровне целого организма	Они могут включать 1) удаление органа (например, гепатэктомия) 2) изменение диеты (голодание—усиленное питание) 3) прием лекарств (например, фенобарбитала) 4) введение токсических веществ (например, четыреххлористого углерода) 5) наблюдение за животным со специфическими заболеваниями (например. сахарным диабетом) 6) использование сложных методов, таких, как ЯМР-спектроскопия и позитронно-эмиссионная томография
Исследование изолированного перфузируемого органа	Наиболее пригодны сердце, печень, почки
Использование тканевых срезов	Особенно срезы печени
Использование целых клеток	1. Особенно это относится к клеткам крови, которые относительно легко поддаются выделению 2. Клетки в культурах тканей являются незаменимым объектом во многих областях биологии
Использование гомогената	1. Позволяет работать с бесклеточными препаратами 2. Можно добавлять или удалять (путем диализа) различные соединения и наблюдать за последствиями 3. Путем центрифугирования можно провести дальнейшее субфракционирование, что позволяет получить индивидуальные клеточные органеллы
Исследование изолированных клеточных органелл	Широко используется для изучения функций митохондрий, эндоплазматического ретикулума, рибосом и т.д.
Субфракционирование органелл	Широко используется, например, при изучении функций митохондрий
Выделение и характеристика метаболитов и ферментов	Важнейшая часть анализа любой химической реакции или метаболического пути
Клонирование генов, кодирующих ферменты и другие белки	Выделение клонированного гена необходимо для изучения деталей его структуры и регуляции; позволяет установить аминокислотную последовательность белка, который им кодируется