Примечания

Рестриктазы – дорогие ферменты! Связанные с ними затраты могут быть

сведены к минимуму, если следовать приведенным ниже правилам.

А. Чтобы отобрать небольшое количество фермента из упаковки с концентрированным раствором рестриктазы, быстро коснитесь кончиком стеклянной микропипетки разового пользования (на 5 мкл) поверхности раствора фермента. Таким способом можно отобрать всего 0,1 мкл раствора фермента.

Б. Рестриктазы стабильны при хранении при –20^оС в буфере, содержащем 50% глицерин. При проведении расщепления ДНК растриктазами приготовьте реакционную смесь, содержащую все компоненты, кроме фермента. Достаньте из морозильника фермент и сразу же поместите его в лед. Работайте как можно быстрее, чтобы фермент находился вне морозильника минимальное время. Сразу же после использования поместите фермент обратно в морозильник.

В. Используйте минимальные объемы реакционной смеси, уменьшая в ней

количество воды, насколько это возможно. Проверьте, однако, чтобы объем внесенной рестриктазы составлял менее 1/10 конечного объема реакционной смеси, иначе активность фермента может ингибироваться глицерином.

Г. Когда ДНК необходимо обработать двумя или более рестриктазами, реакцию можно проводить одновременно при условии, что оба фермента функционируют в одном и том же буфере. В противном случае первым следует использовать фермент, функционирующий в буфере с более низкой ионной силой. После этого в реакционную смесь можно добавить необходимое количество соли и второй фермент (ферменты) и продолжить инкубацию.

Конъюгация бактериальных клеток

Конъюгация бактерий, наблюдаемая при совместном культивировании бактериальных клеток, представляет яв­ление, аналогичное оплодотворению. В процессе конъюгации генетический материал может передаваться от одних бактерий (доноров) другим (реципиентам), проявлением чего служит приобретение бактериями-реципиентами свойств бактерий-доноров.

Пара конъюгирующих бактерий, соединенных F-пилем — структурой, образуемой клеткой-донором. Через F-пиль ДНК попадает в клетку-реципиент.

Коньюгация - это однонаправленный перенос генетического материала от донора ("мужской" клетки) к реципиенту ("женской" клетке). Процесс коньюгации определяют и контролируют особые плазмиды - факторы фертильности. Клетка, содержащая хотя бы одну из таких плазмид, приобретает свойства донора, а лишенная ее - реципиента. Перенос генов донорской хромосомы происходит в линейной последовательности и обычно сопровождается их рекомбинацией с хромосомными генами реципиента.

При конъюгации, для которой необходим непосредственный контакт между бактериальными клетками, осуществляется направленный перенос генетического материала от клетки-донора в клетку-реципиент. Как правило, в клетку-реципиент переносится только часть генетического материала клетки-донора, в результате чего образуется неполная зигота, или мерозигота, содержащая часть генома донора и полный геном клетки- реципиента. Участки перенесенной от донора ДНК находят гомологичные участки в молекуле ДНК реципиента, между которыми происходит генетический обмен. В результате часть донорной ДНК встраивается (интегрируется) в геном реципиента, а соответствующая часть реципиентной ДНК из него исключается.

При конъюгации бактерий, происходит лишь частичный обмен генетической информацией конъюгирующих особей в отличие от конъюгации растений .

Рекомбинация между гомологичными (А) и негомологичными (Б) фрагментами ДНК.

Для успешного установления контакта двух клеток в клетке-доноре должна присутствовать конъюгативная (половая, трансмиссивная) плазмида. Первой из них была открыта F-плазмида: эписома (способная встраиваться в бактериальную хромосому), длиной около 100 тыс. пар оснований. Плазмида несёт гены, кодирующие ряд функций. Одна из них — образование половых пилей, отвечающих за приклепление к клетке-реципиенту.

Конъюгативные плазмиды также кодируют белки, противодействующие прикреплению пилей других бактерий к клеточной стенке данной. Поэтому клетки, уже содержащие трансмиссивные плазмиды, на несколько порядков реже выступают в роли реципиентов при конъюгации.

Плазмидой кодируется эндонуклеаза, разрезающая одну из нитей её ДНК в определённой точке (oriT). Затем разрезанная цепь раскручивается и 5'-концом переносится в клетку-реципиент. К настоящему времени показано, что перенос идёт через поры в клеточной стенке. В первом сегменте поступающей в клетку реципиента нити ДНК расположены антирестрикционные гены. Эти гены должны транскрибироваться в реципиенте сразу же после своего поступления туда, чтобы обеспечить накопление белков, блокирующих процесс разрушения ДНК рестриктазами. Наконец, переданная цепь замыкается в кольцо и на её основе восстанавливается двунитевая структура ДНК плазмиды. Весь процесс длится несколько минут.

Конъюгативная плазмида может встраиваться в хромосому путём гомологичной рекомбинации с участием IS-элементов. Конъюгация при этом идёт по тому же механизу, однако реципиенту передаётся не только плазмида, но и хромосомный материала донора. В этом случае процесс затягивается на часы, часто происходит разрыв передаваемой нити ДНК.