21

Некоторые сведения о работе с векторными ДНК.

Плазмиды

Генетическая система бактерий состоит из ядерных и внеядерных структур. Аналог ядра прокариотов значительно отличается от ядра эукариотических клеток. Он представлен нуклеоидом , лишенным оболочки и включающем в себя почти всю ДНК бактерии. Бактериальная хромосома состоит из одной двунитевой молекулы ДНК кольцевой формы . Молекула ДНК построена из двух полинуклеотидных цепочек. Нуклеотидные цепи антипараллельны: на каждом конце линейной молекулы ДНК расположены 5' -конец одной цепи и 3' -конец другой цепи. Наследственная информация у бактерий хранится в форме последовательности нуклеотидов ДНК, которая определяет последовательность аминокислотных остатков в молекуле белка. Каждому белку соответствует свой ген, т.е., дискретный участок на ДНК, отличающийся числом и специфичностью последовательности нуклеотидов. Бактериальная хромосома содержит до 4000 отдельных генов. Размеры бактериальной хромосомы у различных представителей царства Procaryotae варьируют от 3 х 10 ⁸ до 2,5 х 10 ⁹  Д. Бактериальная клетка гаплоидна, а удвоение хромосомы всегда сопровождается ее делением.

Генетическая информация в бактериях может содержаться во внеядерных (внехромосомных) молекулах ДНК, представленных плазмидами, транспозонами и инсерционными (вставочными) последовательностями. Они не являются жизненно необходимыми, так как не кодируют информацию о синтезе ферментов, участвующих в метаболизме бактериальной клетки. Размеры плазмид необычайно широко варьируют-от 2 тыс. до неск. сотен тысяч пароснований; нек-рые из них содержат 1-3гена, другие достигают 10-20% размера бактериальнойхромосомы. Это двунитевые молекулы ДНК размером до 10⁸ Д, несущие до 50 генов. Количество плазмид в бактериальной клетке может быть от 1 до 200 и несколько более.

Выделяют плазмиды, находящиеся в виде отдельной замкнутой молекулы ДНК и встроенные в хромосому бактерии ( интегрированные плазмиды ).

Некоторые плазмиды, называемые. эписомами, обладают способностью существовать в двух состояниях - автономном и интегрированном. В автономном состоянииэписомане является частью бактериальнойхромосомыи реплицируется (самовоспроизводится) независимо, хотя и синхронно с ней. В интегрирированном состоянии она реплицируется в составехромосомы. Способность обратимо включаться в составхромосомычасто сопряжена с наличием вэписомахмигрирующих генетических элементов.

Плазмиды выполняют регуляторные и кодирующие функции. Первые направлены на компенсацию метаболических дефектов, вторые вносят в бактерию информацию о новых признаках. Как составляющая часть генетического материала бактерии плазмиды играют важную роль в ее жизнедеятельности, детерминируя такие характеристики, как способность продуцировать экзотоксины, ферменты или бактериоцины, устойчивость к лекарственным препаратам и т.д. Удвоение ДНК некоторых плазмид индуцирует деление бактерий, т.е. увеличивает их «плодовитость». Такие плазмиды обозначают как F -плазмиды или F -факторы (от англ. fertility - плодовитость). Интегрированные F -плазмиды называют Hfr -плазмиды или Hfr -факторы (от англ. high frequency of recombinations - высокая частота рекомбинаций). Hfr -факторы осуществляют перенос части генетической информации данной хромосомы в другую клетку.

Плазмиды, детерминирующие устойчивость к лекарственным препаратам, называются R -плазмидами или R -факторами (от англ. resistance - устойчивость). R -плазмиды содержат гены, детерминирующие синтез ферментов, которые разрушают антибактериальные препараты. В результате бактериальная клетка становится устойчивой к действию целой группы лекарственных веществ. Многие R -плазмиды являются трансмиссивными и, распространяясь в популяции бактерий, переносят резистентность к воздействию антибактериальных препаратов. Плазмиды патогенности контролируют вирулентные свойства микроорганизмов, детерминируя синтез факторов патогенности. Так, например, Ent -плазмида определяет синтез энтеротоксина. Развитие инфекционного процесса, вызванного возбудителями чумы, сибирской язвы, кишечного иерсиниоза, клещевого иксодового боррелиоза связано с функционированием плазмид патогенности.

Обусловленная плазмидами устойчивость бактерий к антибиотикам основана на разных механизмах, но чаще всего-на инактивации последних ферментами (напр., b-лактамазы), кодируемых плазмидами, или на избират. изменении проницаемости клеточной оболочки.

Среди плазмид, обеспечивающих устойчивость бактерий к антибиотикам, основную массу составляют так называемые факторы множественной резистентности, несущие сразу несколько соответствующих детерминант. С помощью трансмиссибельных плазмид детерминанты резистентности легко могут распространяться между видами, способными к конъюгации. На такие плазмиды гены резистентности могут передаваться с помощью транспозонов. Кроме детерминант лекарственной резистентности из числа функцией, элементов плазмид хорошо изучены гены нек-рых бактериальных токсинов, например энтеротоксинов, вырабатываемых возбудителями кишечных инфекций, носителями так называемых Тох-плазмид (факторов патогенности энтеробактерий). Показана способность Тох-плазмид передаваться между бактериями в организме животных и человека. На этих плазмидах могут находиться также детерминанты резистентности к антибиотикам. В этой связи активно развивается новое направление в практической бактериологии - поиск и создание веществ, избирательно подавляющих репликацию плазмид или экспрессию их генов. Пример таких веществ - клавулановая кислота и ее производные - ингибиторы b-лактамазы.

Конъюгативные плазмиды переносятся от бактерии к бактерии внутри вида или между представителями близкородственных видов в процессе конъюгации. Чаще всего конъюгативными плазмидами являются F - или R -плазмиды. Подобные плазмиды относительно крупные (25-150 млн Д) и часто выявляются у грамотрицательных палочек. Большие плазмиды обычно присутствуют в количестве 1-2 копий на клетку и их репликация тесно связана с репликацией бактериальной хромосомы. Неконъюгативные плазмиды обычно имеют небольшие размеры и характерны для грамположительных кокков, но встречаются также у некоторых грамотрицательных микроорганизмов (например, у Haemophilus influenzae , Neisseria gonorrhoeae ). Мелкие плазмиды могут присутствовать в больших количествах (более 30 на клетку), так как только наличие такого количества обеспечивает их распределение в потомстве во время клеточного деления. При наличии в бактерии одновременно конъюгативных и неконъюгативных плазмид донор может передавать и неконъюгативные плазмиды за счет связывания генетического материала последних с факторами, обеспечивающими их перенос в процессе конъюгации.

ВЫДЕЛЕНИЕ ПЛАЗМИДНОЙ ДНК ИЗ БАКТЕРИЙ

Для выделения плазмидной ДНК пользуются многими методами. Все они включают три основных этапа: рост бактерий и амплификацию плазмиды; сбор бактерий и их лизис; очистку плазмидной ДНК.

Амплификация в богатой среде

Амплификацию плазмид производят при выращивании бактерии-хозяина в богатой среде в присутствии хлорамфеникола. Ночную культуру (10 мл LB c добавлением антибиотика) пересевают в свежую среду LB (0.2 мл н.к. в 25 мл LB c антибиотиком) и инкубируют пока культура не достигнет поздней логарифмической фазы (D600=0,6).

Переносят культуру в свежую среду LB с антибиотиком (500 мл), инкубируют 2,5 часа (при этом титр удваивается), добавляют антибиотик до концентрации 170 мкг/мл и инкубируют еще 12-16 ч.

Лизис клеток

Разрушения бактерий для последующего выделения биологически активной ДНК можно добиться разными способами.

- Механические. При этом происходят многочисленные разрывы ДНК.

- У многих бактерий наступает лизис после добавления анионного детергента

додецилсульфата (или лаурилсульфата). В частности, так можно разрушить

бактерии кишечной группы, пневмококки и гемофильные бактерии.

Додецилсульфат не только разрушает клетки, но и денатурирует некоторые белки. Однако затем он должен быть полностью удален из лизата (что и достигается при последующих обработках), так как его примесь в трансформирующей ДНК мешает самому процессу трансформации.

Некоторые грамположительные бактерии нельзя разрушить только

додецилсульфатом или другими поверхностно-активными веществами. Вначале нужно удалить клеточную стенку и затем применить тот или иной детергент. Для разрушения клеточной стенки чаще всего применяют лизоцим. При концентрациях, которые чаще всего применяются для разрушения бактериальных клеток (50-500 мкг/мл), функции лизоцима сводятся к разрушению клеточной стенки, в результате чего образуются хрупкие протопласты, легко разрушаемые детергентами. При больших концентрациях лизоцим может, видимо, влиять на связь ДНК с цитоплазматической мембраной и даже связываться с ДНК, осаждая ее. Кроме лизоцима, для той же цели употребляют проназу. Проназа способствует более полному гидролизу белка и поэтому лучшей последующей депротеинизации ДНК.

При разрушении бактерий в лизате в числе прочих ферментов появляются

дезоксирибонуклеазы. Они, если действие их чем-либо не блокировано, могут тут же разрушить ДНК. Обычно от них защищаются, добавляя вещества, которые связывают ионы магния, требующиеся для работы большинства ДНКаз.

Вещества, связывающие ионы магния (ЭДТА, цитрат), которые добавляют при лизисе клеток для инактивации дезоксирибонуклеаз и предохранения выделяющейся ДНК, подавляют поглощение ДНК компетентными клетками. Додецилсульфат и дезоксихолат также подавляют трансформацию. Лизоцим и проназа, остающиеся в лизате, сами могут лизировать компетентные клетки. В ряде случаев от нежелательных примесей, мешающих трансформации, можно избавиться за счет его разведения.

Для депротеинизации лизата при выделении ДНК используют обработку

фенолом, который осаждает додецилсульфат и инактивирует все белки, в том числе и дезоксирибонуклеазы.

Существуют различные методики лизиса. Лизис кипячением и лизис щелочью), отличаются высокой эффективностью и в случае малых плазмид (не более 10 kb) дают выход 2-3 мг/л. Лизис под действием SDS сравнительно более мягкий, и им следует пользоваться в случае больших плазмид ( ≥10 kb).

Очистка ДНК

В этих методах очистки так или иначе используют два основных различия между хромосомальной ДНК бактерий и плазмидной ДНК:

1) хромосомы бактерий по размеру много больше ДНК плазмид, обычно используемых в качестве векторов;

2) основная масса ДНК бактерий выделяется из клеток в виде фрагментированных линейных молекул, тогда как большинство плазмидной ДНК экстрагируется в виде ковалентно замкнутых кольцевых молекул.

Поэтому большинство методов очистки включают осаждения, при которых из препарата удаляются преимущественно длинные цепи ДНК бактерий, случайно захваченные обломки лизированных клеток. Методики эти основаны также на использовании свойств кольцевой замкнутой ДНК. Каждая из комплементарных цепей плазмидной ДНК представляет собой ковалентно замкнутое кольцо, поэтому цепи нельзя отделить друг от друга (не разорвав одну из них) в тех условиях, при которых происходит разрыв большинства водородных связей в ДНК, например при нагревании

или при выдерживании в умеренно щелочных растворах (до рН 12,5). При охлаждении или возвращении к нейтральному рН замкнутые кольцевые молекулы вновь принимают нативную конформацию, тогда как ДНК бактерий остается денатурированной.

Плазмидная ДНК ведет себя отлично от ДНК бактерий также и при равновесном центрифугировании в градиенте хлористого цезия, содержащих какой-нибудь интеркалирующий краситель в насыщающей концентрации, например бромистыйэтидий или дийодистый пропидий. Ковалентно замкнутые кольцевые ДНК связывают меньше такого красителя, чем линейная ДНК, и поэтому в градиентах хлористого цезия, содержащих интеркалирующий агент, оказываются в зонах с более высокой плотностью. Эту методику используют, если необходима высокая степень очистки плазмидной ДНК. Однако по мере развития методов работы с рекомбинантной ДНК для многих целей оказалось уже необязательным проводить очистку больших количеств плазмидной ДНК до такой степени, чтобы препарат был гомогенным. Например, расщепление рестриктирующими эндонуклеазами, лигирование, трансформацию и даже секвенирование ДНК можно проводить теперь, используя относительно малоочищенные препараты плазмидной ДНК, полученные из небольших объемов культуры (около 10 мл). Плазмидную ДНК выделяют из больших объемов культуры лишь в тех случаях, когда нужны значительные ее препараты (например, в опытах по гибридизации для отбора специфических мРНК или когда нужно пометить 5`-концы фрагментов ДНК с помощью полинуклеотидкиназы).

Описанные ниже методики можно успешно использовать для выделения разнообразных плазмид из различных штаммов бактерий. Вообще говоря, чем меньше плазмида, тем лучше достигаемые результаты. С увеличением молекулярной массы плазмиды ее свойства становятся все ближе к свойствам ДНК хозяина. Выделение плазмид, размер которых превышает 25 kb, сильно затрудняется и выход оказывается невысоким. Однако все плазмиды, обычно используемые при клонировании, относительно невелики и приведенные ниже методы дают хорошие результаты.

Выделение препаративных количеств плазмидной ДНК щелочным методом из клеток бактерий

1. Наращиваем культуру в 150 мл среды LB+Amp при 37^оС (20-24 часа).

2. Осаждаем клетки (4000 об/мин, 15 мин).

3. Ресуспендируем клетки в 2.4 мл раствора I, содержащего 2 мг/мл лизоцима

(лизоцим не работает, если рН <8.0).

4. Выдерживаем 15 мин во льду.

5. Добавляем 4.8 мл свежеприготовленного раствора II. Пробирку закрываем

парафилмом и переворачиваем несколько раз осторожно!

6. Выдерживаем 5-10 мин в ледяной бане.

7. Добавляем 7.2 мл охлажденного раствора III. Резко переворачиваем

пробирку, заклеенную парафилмом.

8. Выдерживаем 30-60 мин в ледяной бане.

9. Центрифугируем 20 мин при 6000 об/мин при 4^оС.

10. К супернатанту добавляем 2V этанола и выдерживаем 1 час в морозильнике

(-20^оС).

11. Центрифугируем 30 мин при 6000 об/мин при 4^оС.

12. Осадок растворяем в 1 мл ТЕ-буфера.

Выделение плазмидной ДНК модифицированным методом щелочного лизиса по Бирнбойму и Долли

Для выделения ДНК культуру клеток выращивают в 3 мл в течение 16 часов при 37^оС при интенсивной аэрации. Клетки осаждают центрифугированием на настольной центрифуге, промывают раствором "А"(50 мM Трис-HCl pH 8.0; 25 мM ЭДТА; 10%сахароза) и инкубируют в 100 мкл того же раствора в присутствии 100 мкг/мл лизоцима. Денатурацию проводят добавлением 200 мкл раствора "B", состоящего из 200 мM NаОН и 1%-ого додецилсульфата натрия в течение 1-2 мин. Pенатурацию проводят на ледяной бане в течение 15 мин добавлением 150 мкл раствора "С" (3 М ацетат калия, рН 4.8). После центрифугирования в течение 10 мин при 3000 об/мин отбирают супернатант и осаждают из него ДНК с помощью ПЭГ-8000 (Sigma) в конечной концентрации 6.5%. Осадок промывают 70%-ным этанолом, высушивают и растворяют в 100мкл воды. Очистку от примесей РНК осуществляют с помощью инкубации в течение 20 мин при 65^оС в растворе LiCl и ацетата аммония в конечных концентрациях 3 М и 2.8 М соответственно. После центрифугирования в течение 10 мин при 3000 об/мин ДНК из супернатанта осаждают равным объемом изопропанола, промывают 70% этанолом, высушивают и растворяют в воде.

Амплификация и выделение низкокопийных плазмид

Амплификация плазмиды

1. засеять на ночную инкубацию 1 колонию в 5ml среды LB с необходимым антибиотиком;

2. в 3 колбы (по 750ml) разлить по 150ml среды LB, внести по 1ml ночной культуры клеток, добавить антибиотик;

3. подращивать на качалке до D₆₀₀=1;

4. добавить в каждую колбу по 10mg хлорамфеникола и по 200µl 40% глюкозы;

5. инкубировать ночь на качалке;

Щелочное выделение ДНК

6. ЦФ 8krpm 10';

7. ресуспендировать бактерии в 10ml H₂O;

8. добавить 20ml раствора (0.2 M NaOH, 1% SDS), тщательно перемешать, 20-15' инкубации на столе;

9. добавить 15ml 3М NaA c pH 5.0, тщательно перемешать, инкубировать в холодильнике (+4^OС) 1h (можно и на ночь оставить);

10. ЦФ 12 krpm 15';

11. супернатант перелить, добавить к нему 80ml этанола, перемешать, инкубировать 30' при -20^OС;

12. ЦФ 12 krpm 10';

13. растворить в 1-2ml H₂O, разлить в 1.5ml пробирки;

14. добавить 5M LiCl в пропорции 1:1. Перемешать, инкубировать 10' при -70^OС;

15. ЦФ 12 krpm 10';

16. к супернатанту добавить двойной объём этанола, перемешать;

17. ЦФ 12 krpm 10';

18. растворить в 800µl H₂O;

19. добавить 10µl RNase A (10mg/ml);

Очистка ДНК на колонке

20. добавить к раствору ДНК 1g CsCl, растворить;

21. инкубировать ночь при +4^OС

22. ЦФ 12 krpm 10';

23. к супернатанту добавить краску для нанесения на форез и нанести на колонку с сефарозой СL-2B в TE буфере;

24. снимать фракции по 0.5-1ml;

25. проверить наличие ДНК во фракциях на 1% агарозе;

26. провести диализ фракций с ДНК в буфере ТЕ.

ОЧИСТКА ВЫДЕЛЕННЫХ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ

Одной из самых важных процедур в молекулярном клонировании является

очистка нуклеиновых кислот. Ключевой этап – удаление белков – часто проводят с помощью экстракции водных растворов нуклеиновых кислот фенолом и (или) хлороформом. Такую экстракцию используют там, где нужно инактивировать и удалить ферменты, применяемые на одном из этапов клонирования, прежде чем перейти к следующему. Если же нуклеиновые кислоты выделяют из сложных смесей молекул, таких как клеточные лизаты, то необходимо прилагать дополнительные усилия. В таких случаях прежде чем проводить экстракцию органическими растворителями, чаще всего удаляют большинство белков гидролизом их протеолитическими ферментами, такими, как проназа или протеинкиназа К (табл.), которые активны в отношении широкого спектра нативных белков.

ОСАЖДЕНИЕ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ ЭТАНОЛОМ ИЛИ ИЗОПРОПАНОЛОМ

Наиболее часто используемый метод концентрирования ДНК – осаждение ее

этанолом. Осадок ДНК, образующийся при низкой температуре (-20^оС или ниже) в присутствии умеренной концентрации моновалентных катионов, собирают центрифугированием и вновь растворяют в соответствующем буфере, доводя до желаемой концентрации. Эта процедура является быстрой и количественной, даже если ДНК присутствует в нанограммах.

1. Определите объем раствора ДНК.

2. Доведите до необходимой концентрацию моновалентных катионов либо путем разведения буфером ТЕ, рН 8,0, если в растворе ДНК имеется высокая

концентрация солей, либо путем добавления одного из солевых растворов.

3. Хорошо размешайте. Добавьте точно 2 объема охлажденного во льду этанола и снова хорошо размешайте. Охладите до –20^оС.

4. Оставьте при низкой температуре, чтобы ДНК выпала в осадок. Обычно для этого требуется 30-60 мин при –20^оС, но когда размер ДНК мал (меньше 1 kb) или когда она присутствует в небольших колличествах (меньше 0,1 мкг/мл), нужно увеличить время выдерживания или понизить температуру до –70^оС.

5. Центрифугируйте при 0^оС. В большинстве случаев достаточно центрифугировать 10 мин в центрифуге Эппендорф или при 12 000 g. Однако при работе с раствором ДНК низкой концентрации или содержащим очень мелкие фрагменты ДНК может потребоваться более интенсивное центрифугирование (например, 30 мин при 30 000 об/мин в роторе Beckman SW50.1).

6. Удалите надосадочную жидкость. Оставьте пробирку в перевернутом положении на листе фильтровальной бумаги, чтобы как следует стекла вся жидкость. Фильтровальной бумагой удалить все капли со стенок пробирки.

7. Растворите осадок ДНК в соответствующем объеме буфера. Хорошо ополосните буфером стенки пробирки, чтобы собрать всю ДНК. Для ускорения растворения осадка можно прогреть пробу при 37^оС в течение 5 мин.

Примечания. а) Вместо двух объемов этанола для осаждения ДНК можно взять 1 объем изопропанола. Преимущество такой замены состоит в меньшем объеме центрифугируемой жидкости. Но изопропанол менее летуч, чем этанол, поэтому его следы труднее удалить из раствора; кроме того, некоторые растворенные соединения, такие как сахароза или NaCl, легче осаждаются вместе с ДНК при использовании изопропанола, особенно при –70^оС. В общем, если не требуется сводить к минимуму объем жидкости, осаждение предпочтительнее проводить этанолом.

б) Для удаления примесей, захватываемых осадком, можно промыть осадок ДНК раствором 70%-ного этанола. Чтобы при промывании не потерять часть ДНК, заполняйте пробирку 70%-ным этанолом не более чем на 2/3. Встряхивайте непродолжительное время и центрифугируйте так, как описано выше. Осадок, остающийся после промывания 70%-ным этанолом, не очень прочно связан со стенками пробирки, поэтому будьте очень осторожны при удалении надосадочной жидкости.

в) Очень короткие молекулы ДНК (меньше 200 пар оснований) плохо осаждаются этанолом. Однако эффективность их осаждения значительно увеличивается, если, предварительно к раствору ДНК добавить MgCl₂ до концентрации 0,01 М.

г) Как правило, ДНК, осажденная этанолом, легко вновь растворяется в буферах с низкой ионной силой, таких, как буфер ТЕ.

РЕСТРИКТНЫЙ АНАЛИЗ ДНК