Добавил:
Upload Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз: Предмет: Файл:
Гусейнов / Лекция 2.12 ПЦР.doc
Скачиваний:
154
Добавлен:
10.06.2015
Размер:
381.44 Кб
Скачать

Полимеразная цепная реакция

Полимера́зная цепна́я реа́кция (ПЦР) — экспериментальный метод биохимии, позволяющий добиться значительного увеличения малых концентраций определённых фрагментовДНКв биологическом материале.

Помимо амплификации (увеличения числа копий) ДНК, ПЦР позволяет производить множество других манипуляций с нуклеиновыми кислотами (введение мутаций, сращивание фрагментов ДНК) и широко используется в биологической и медицинской практике, например, для диагностики заболеваний (наследственных, инфекционных), для установления отцовства, дляклонированиягенов, выделения новыхгенов.

История разработки пцр

В начале 1970-х годовнорвежскому ученомуХьеллю Клеппеиз лаборатории нобелевского лауреатаХара Гобинды Хораныпришла в голову мысль, что можно амплифицировать ДНК с помощью пары коротких одноцепочечных молекул ДНК — синтетическихпраймеров.

В то время эта идея осталась невостребованной. Зато в 1983 году она была успешно реализована Кэри Маллисом.

Его целью было создание метода, который бы позволил амплифицироватьДНК в ходе многократных последовательныхудвоенийисходной молекулы ДНК с помощью ферментаДНК-полимеразы.

Через 7 лет после опубликования результатов своих исследований, в 1993 г., Маллис получил за создание метода ПЦР Нобелевскую премию.

В основе метода ПЦР лежит природный процесс - комплементарное достраивание ДНК матрицы, осуществляемое с помощью фермента ДНК-полимеразы. Эта реакция носит название репликации ДНК.

Естественная репликация ДНК включает в себя несколько стадий:

1) Денатурация ДНК (расплетение двойной спирали, расхождение нитей ДНК);

2) Образование коротких двухцепочечных участков ДНК (затравок, необходимых для инициации синтеза ДНК);

3) Синтез новой цепи ДНК (комплементарное достраивание обеих нитей)

Кэри Маллис доказал, что данный процесс можно применить для получения копий коротких участков ДНК, специфичных для конкретных организмов, т.е. осуществлять целенаправленный поиск таких специфических участков.

Чтобы произвести денатурацию ДНК, её нагревают.

В начале использования метода после каждого цикла нагревания — охлаждения приходилось добавлять в реакционную смесь новую порцию ДНК-полимеразы, так как она быстро инактивировалась при высокой температуре, необходимой для разделения цепей спирали ДНК. Процедура была очень неэффективной, требовала много времени и фермента.

В 1986 годуметод полимеразной цепной реакции был существенно улучшен. Было предложено использовать ДНК-полимеразы из термофильных бактерий. Эти ферменты оказались термостабильными и были способны выдерживать множество циклов реакции.

Их использование позволило упростить и автоматизировать проведение ПЦР. Одна из первых термостабильных ДНК-полимераз была выделена из бактерий Thermus aquaticus и названа Taq-полимеразой. Недостаток этой полимеразы заключается в том, что вероятность внесения ошибочного нуклеотида у неё достаточно высока, так как у этого фермента отсутствуют механизмы исправления ошибок (3'→5' экзонуклеазнаяактивность).

Полимеразы Pfu и Pwo, выделенные из архей, обладают таким механизмом, их использование значительно уменьшает число мутаций в ДНК, но скорость их работы (процессивность) ниже, чем уTaq. Сейчас применяют смеси Taq и Pfu, чтобы добиться одновременно высокой скорости полимеризации и высокой точности копирования.

В момент изобретения метода Маллис работал в компании Цетус (en:Cetus Corporation), которая и запатентовала метод ПЦР. В1992 годуЦетус продала права на метод и патент на использованиеTaq-полимеразы компании Хофман-Ла Рошза 300 млн долларов. Однако оказалось, чтоTaq-полимераза была охарактеризована русским биохимиком Алексеем Калединым в 1980 году, в связи с чем компания Промега (Promega) пыталась в судебном порядке заставить Рош отказаться от исключительных прав на этот фермент. Американский патентна метод ПЦР истёк в марте 2005 г.