Гусейнов / Лекция 2 Гусейнов

Определение общего белка в сыворотке крови

Белки сыворотки крови представляют собой гетерогенную группу белков, включающую транспортные белки, ферменты, иммуноглобулины, гормоны, белки-ингибиторы и многие другие. Несмотря на различия в составе, структуре, физических и химических свойствах и выполняемой функции, белкам сыворотки присущ ряд общих характеристик:

1. обладают поглощением в ультрафиолетовой области спектра;

2. сходно ведут себя в ряде химических реакций.

Методы определения общего белка

Среди методов определения концентрации общего белка можно выделить несколько основных групп, основанных на различных принципах:

• азотометрические;

• гравиметрические (весовые);

• «преципитационные»;

• спектрофотометрические;

• рефрактометрические;

• колориметрические.

Кроме перечисленных выше разработаны также другие методы, например, флюориметрические, поляриметрические, а также методы атомно-абсорбционной спектрофотометрии и аминокислотного анализа белка.

Азотометрические методы

Азотометрические методы определения общего белка сыворотки основаны на определении количества белкового азота, образующегося при разрушении аминокислот, входящих в состав белков. Впервые метод был предложен Кьельдалем в 1883 году. В методе Кьельдаля, в настоящее время представляющем в целом исторический интерес, азот, содержащийся в составе белков, окисляют до иона аммония и его количество определяют титрованием точным раствором соляной кислоты. Кроме того, ион аммония может быть определен реактивом Несслера, манометрическим методом после превращения иона аммония в молекулярный азот под действием гипобромита или с помощью оптического теста Варбурга при участии фермента глутаматдегидрогеназы. Исходя из того, что белки из биологических объектов содержат в среднем 16 % азота, полученное в результате анализа количество азота умножают на коэффициент 6,25. Исторически используют фактор 6,25, хотя его величина зависит от белкового состава исследуемого образца. Для отдельных фракций белка в сыворотке или плазме величина фактора колеблется в диапазоне от 5,69 до 6,52.

Недостатком азотометрических методов является длительность и сложность процедуры, даже при том, что аммиак, образующийся в реакции, можно определять ферментативным методом. Автоматизация позволяет использовать этот метод в ряде случаев в качестве метода сравнения из-за его достаточной точности и воспроизводимости.

Гравиметрические методы

Гравиметрические (весовые) методы определения общего белка сыворотки основаны на высушивании белков до постоянной массы и взвешивании на аналитических весах. Методы трудоемки и в настоящее время практически не используются для определения общего белка сыворотки. Гравиметрический метод продолжает использоваться в некоторых лабораториях для определения фибриногена в плазме крови.

«Преципитационные» методы

«Преципитационные» методы определения общего белка основаны на снижении растворимости белков и образовании суспензии взвешенных частиц под воздействием различных агентов. О содержании белка в исследуемой пробе судят либо по интенсивности светорассеяния (нефелометрический метод анализа), определяемого числом светорассеивающих частиц, либо по ослаблению светового потока образовавшейся суспензией (турбидиметрический метод анализа).

Результаты данной группы методов зависят от множества факторов: скорости смешивания реактивов, температуры реакционной смеси, значения рН среды, присутствия посторонних соединений, способов фотометрии. Тщательное соблюдение условий реакции способствует образованию стабильной суспензии с постоянным размером взвешенных частиц и получению воспроизводимых результатов. «Преципитационные» методы для определения белка в сыворотке крови не получили признания и нашли применение при определении белка в моче, спинномозговой жидкости и многих индивидуальных белков с использованием специфических антител.

Спектрофотометрические методы

Спектрофотометрические методы определения общего белка сыворотки крови основаны на измерении светопоглощения в ультрафиолетовой области.

Растворы белка обладают поглощением при 270–290 и 200–225 нм. Поглощение при 270–290 нм определяется присутствием в молекуле белка ароматических аминокислот — тирозина, триптофана и фенилаланина. Поглощение при 200–225 нм практически в 20 раз выше, чем при 280 нм, и обусловлено главным образом пептидными связями.

Точность и специфичность методов определения белка, основанных на поглощении при 270 –290 нм, невелика, поскольку содержание тирозина и триптофана может колебаться в различных белках сыворотки крови. Кроме того, присутствие в сыворотке свободных аминокислот — тирозина и триптофана, мочевой кислоты и билирубина, поглощающих при 280 нм, вносит определенную погрешность. В связи с этим данный метод не используют для прямого определения содержания общего белка в сыворотке.

Напротив, поглощение в ультрафиолетовой области — 200 – 225 нм обусловлено в основном пептидными связями, в связи с чем величина поглощения различных белков сыворотки различается незначительно. В этом спектральном диапазоне закон Бера соблюдается при концентрации белка в сыворотке до 120 г/л.

Определение общего белка сыворотки крови с помощью прямой фотометрии при 210 нм обеспечивает получение результатов, сравнимых с биуретовым методом и методом Кьельдаля. В то же время данный метод практически не применяется из-за необходимости использования кювет, не поглощающих при 210 нм, и монохроматора, что удорожает метод.

Рефрактометрические методы

Рефрактометрические методы определения общего белка сыворотки основаны на способности растворов белка к преломлению светового потока. При температуре 17,5 °С показатель преломления воды равен 1,3332, при той же температуре показатель преломления сыворотки колеблется в пределах 1,3480–1,3505. В связи с тем, что концентрация электролитов и небелковых органических соединений, влияющих на ее преломляющую способность, невелика и достаточно постоянна в сыворотке здорового человека, величина показателя преломления сыворотки крови зависит в первую очередь от содержания в ней белков. Калибровку прибора проводят сывороткой с известной концентрацией белка. Простота делает рефрактометрию удобным методом для определения содержания общего белка в сыворотке крови, хотя при ряде заболеваний, в частности, при сахарном диабете, хронической почечной недостаточности его использование может приводить к существенной ошибке.

Колориметрические (фотометрические) методы

Колориметрические методы определения общего белка основаны на цветных реакциях белков с хромоген-образующими реактивами или на неспецифическом связывании красителя.

Среди колориметрических методов определения концентрации общего белка сыворотки наиболее распространенным считается биуретовый метод, основанный на так называемой «цветной биуретовой реакции», в ходе которой белки реагируют в щелочной среде с сульфатом меди с образованием соединений, окрашенных в фиолетовый цвет, интенсивность окраски зависит от концентрации общего белка в сыворотке. Биуретовый метод определения общего белка в сыворотке крови был утвержден в качестве унифицированного в 1972 г.

Колориметрические методы определения общего белка сыворотки крови достаточно просты и относительно дешевы. К недостатку метода относится интерферирующее действие некоторых веществ (в том числе лекарств).

Другие методы определения общего белка сыворотки крови

Флюориметрические и другие современные методы определения общего белка (например, поляриграфический микрометод или атомно-абсорбционный анализ) обладают высокой чувствительностью и специфичностью, однако необходимость ввода специальной аппаратуры, а иногда и специальной квалификации аналитика наряду с достаточно высокой стоимостью определения делает этот метод достоянием научно-исследовательских учреждений и значительно ограничивает его использование в клинической лаборатории.

Клиническое значение определения общего белка сыворотки крови

Определение концентрации белка в крови является важным этапом диагностики большого числа заболеваний и служит важным критерием в определении функционального состояния организма. Именно поэтому этому исследованию всегда уделялось особое внимание. За свою историю определение концентрации белка в крови претерпело более чем значительные изменения. Знание точной концентрации белка в крови необходимо врачу-клиницисту для адекватной оценки состояния пациента, выбора соответствующей терапии, а также для отслеживания динамики процесса и, соответственно, для дальнейшего прогноза.

Идеального метода определения концентрации белка пока не существует. У каждого метода есть свои достоинства и недостатки, поэтому в зависимости от цели исследования подбирают наиболее подходящий метод. Например, для практического применения в клинических лабораториях методы, относящиеся к большинству групп настоящей классификации, не могут быть использованы в силу своей трудоемкости и громоздкости, хотя и обладают достаточно высокой точностью.

СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА МЕТОДОВ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ БЕЛКА

Метод определения концентрации белка в крови используемый в клинической лаборатории должен отвечать следующим критериям:

· Достаточно чувствителен · Достаточно специфичен · Надежен · Прост в исполнении · Экономичен · Высокая стабильность комплекса “белок-реактив” · Возможность проведения контроля качества

Наиболее часто в клинических лабораториях используют методы определения концентрации белка, которые относятся к преципитационной и фотометрической группам вышеизложенной классификации.

Метод преципитации с сульфосалициловой кислотой

Принцип метода. Метод основан на свойстве сульфосалициловой кислоты реагировать с белком, вызывая помутнение, интенсивность которого пропорциональна содержанию белка в моче.

Реактивы.

1. Раствор сульфосалициловой кислоты, 30 г/л.

2. Раствор хлорида натрия изотонический (9 г/л).

3. Стандартный раствор альбумина (1%) на изотоническом растворе хлорида натрия.

Ход определения.

Перед исследованием пробы крови необходимо подвергнуть центрифугированию при 1500 об/ мин в течение 10-15 минут.

К 1 мл разведенной плазмы добавляют 3 мл 3% раствора сульфосалициловой кислоты, смесь перемешивают и через 10 мин измеряют экстинцию содержимого пробирки на фотоэлектроколориметре при красном (оранжевом) светофильтре (длина волны 590-650 нм) в кювете с длиной оптического пути 5 мм.

Расчет производят по калибровочному графику. При содержании белка в пробе более 0,5 г/л её необходимо разводить дистиллированной водой. Фактор разведения учитывают при окончательном определении результатов. Мутность проб обусловливает ложнозавышенные результаты.

Метод определения белка по реакции с БФС

Этот метод является достаточно новым и перспективным для применения в клинических лабораториях, особенно в тех, пропускная способность которых более 100 проб крови в сутки.

БФС – тетрабромфенолсульфофталеин - индикатор из группы сульфофталеинов. Визуальный переход окраски от желтой через зеленую к фиолетово-синей в пределах рН 3,0-4,6.

Принцип метода. Образование комплекса зеленовато-голубого цвета обусловлено взаимодействием красителя с аминогруппами белков. Реакция взаимодействия белков крови с красителем в буфере при рН 3,0 сопровождается сильным светопоглощением при 597 нм. Кислая среда необходима для образования соединения “краситель-белок”, при этом увеличивается количество положительно заряженных групп белка. Важно, чтобы краситель имел рН ниже его визуального переходного интервала, что обеспечивает более высокую чувствительность ответа при его взаимодействии с белками.

Реактивы.

1. Основной раствор индикатора. 40 мг БФС растворяли в 100 мл дистиллированной воды, в которую предварительно вносили 60мкл 0,1н раствора едкого натра.

2. Фосфатно-цитратный буфер с рН 3,0 получали смешиванием 205 мл 0,8 моль/л раствора двухзамещенного фосфата натрия с 795 мл 0,4 моль/л раствора лимонной кислоты.

3. Хромогенный реактив получали смешиванием 960 мл буферного раствора с 40 мл основного раствора индикатора. Реактив стоек при комнатной температуре 1 месяц.

4. Стандартный раствор альбумина (1%). 500 мг лиофилизированного сывороточного альбумина (“REANAL” Hungary) растворяли в мерной колбе в 50 мл дистиллированной воды.

Ход определения. В ходе определения к 1 объемной части пробы добавляют 5 объемных частей хромогенного реактива. Выход на постоянный результат через 3 минуты. Стабильность светопоглощения остается неизменной в течение 8 часов вне зависимости от концентрации белка в пробе. Фотометрируют против контроля при 597 (590-610) нм в кювете с толщиной поглощающего слоя 5 мм. Расчет проводится с использованием калибровочной кривой или по формуле при фотометрировании против стандартного раствора альбумина. Полученные данные были подвергнуты статистической обработке, по результатам которой можно сделать вывод, что метод с использованием сульфосалициловой кислоты занижает концентрацию белка в пробе крови, по сравнению с бромфеноловым синим.

Биуретовый метод

Принцип метода: биуретовый метод основан на способности растворов белка давать фиолетовое окрашивание при взаимодействии с раствором сульфата меди в щелочной среде. Интенсивность окраски пропорциональна концентрации белка в растворе.

Реактивы:

1. стандартный раствор белка, содержащий 10 мг в 1 мл ( 10 г/л );

2. биуретовый реактив – 0,15 г CuSO₄ 5H₂O и 0,6 г NaKC₄H₄O₆·4H₂O (виннокислый натрий-калий, или сегнетова соль) растворяют в 50 мл Н₂О, при энергичном перемешивании приливают туда 30 мл 10%-ного раствора NaOH (свободного от Na₂CO₃), добавляют 0,1 г КI и доводят водой до 100 мл. Хранят в полиэтиленовой склянке.

Ход работы: в 4 сухие пробирки вносят по 0,5 мл раствора белка. В три пробирки помещают стандартные растворы с содержанием белка 2,5; 5,0; 7,5 мг в 1 мл. Эти пробирки служат для построения калибровочной кривой. В 4-ю пробирку наливают раствор с неизвестной концентрацией белка, которую необходимо определить.

В каждую пробирку добавляют по 2 мл биуретового реактива. Содержимое пробирок хорошо перемешивают и оставляют при комнатной температуре на 20 мин для развития окраски. Окрашенные растворы колориметрируют на ФЭКе в кюветах с длиной оптического пути 5 мм, пользуясь зеленым светофильтром (длина волны 540 нм). В качестве контрольного раствора используют биуретовый реактив.

Строят калибровочный график, откладывая на оси абсцисс концентрации стандартных растворов белка, а на оси ординат – соответствующие значения оптической плотности. Зная оптическую плотность раствора белка с неизвестной концентрацией, по калибровочной кривой определяют в нем содержание белка.

Микробиуретовый метод

Принцип метода: микробиуретовый метод основан на способности растворов белка давать фиолетовое окрашивание при взаимодействии с раствором сульфата меди в щелочной среде. Интенсивность окраски пропорциональна концентрации белка в растворе.

Реактивы:

1. стандартный раствор белка, содержащий 1 мг в 1 мл;

2. биуретовый реактив (реактив Бенедикта) – 17,3 г цитрата натрия и 10 г Na₂CO₃ растворяют при подогревании в небольшом количестве воды, в раствор добавляют 1,73 г сульфата меди, растворенного в 10 мл воды, и доводят водой до 100 мл; 6%-ный раствор NaOH.

Ход работы: к 2 мл раствора, содержащего 0,1-2,0 мг белка, добавляют 2 мл 6%-ного раствора NaOH и 0,2 мл раствора Бенедикта. Раствор хорошо перемешивают и через 15 мин фотометрируют при 530 нм на спектрофотометре. Предварительно строят график по стандартному раствору белка.

Метод Брэдфорда

Принцип метода: метод основан на связывании с белками одного из кислых красителей кумасси синего. При связывании с белками спектр поглощения красителя меняется. Интенсивности окраски от концентрации белка в пробе в диапазоне 1-10 мкг/мл имеет линейную зависимость. Поскольку белки различаются по своей способности связывать красители, желательно строить калибровочный график с использованием того белка, концентрацию которого в дальнейшем предполагают определить.

Реактивы:

1. стандартный раствор белка, содержащий 0,05 мг/мл.

2. раствор красителя – 10 мг кумасси G-250 гомогенизируют в стеклянном гомогенизаторе в 5 мл 95%-ного спирта, полученный раствор смешивают с 10 мл 95%-ной фосфорной кислоты, разводят до конечного объема 100 мл. Отфильтрованный раствор красителя хранится около 2 недель.

Ход работы: 1,5 мл раствора, содержащего от 10 до 50 мкг белка, смешивают с 1,5 мл раствора красителя. Через 3-5 мин измеряют оптическую плотность при 595 нм, используя в качестве контроля пробу, не содержащую белка. В описанной модификации А₅₉₅ линейно зависит от количества белка в интервале от 10 до 50 мкг.

Метод Лоури

Принцип метода: В щелочной среде ионы Cu⁺² образуют комплекс с пептидными связями, переходя в Cu⁺. Одновалентные ионы меди реагируют с реактивом Фолина (фосфомолибденовая кислота с фенолом), образуя нестабильный продукт, переходящий в молибденовую синь, с максимумом адсорбции при 750 нм. Увеличение адсорбции при 750 нм пропорционально концентрации белка. Метод очень чувствителен к наличию в растворе посторонних восстановителей (что затрудняет его использование при определении белка в неочищенных препаратах), чувствительность к белку - 10 - 100 мкг/мл.

Реактив Фолина готовят след. образом: 100 г вольфрамата Na, 150 мл H₂O и 33 мл 85%-ной H₃PO₄ кипятят с обратным холодильником в течение часа; добавляют 0,2-0,25 мл Br₂ и кипятят до удаления паров последнего, затем разбавляют водой до 1 л

Ход работы: Довести объём образца до 0.8ml водой;

добавить 0.2ml 50% ТХУ (конечная концентрация 10%);

перемешать, подождать 10' и центрифугировать 10' при 14000rpm;

супернатант слить и добавить к осадку      150µl 1М NaOH,      50µl 10% SDS,      0.75ml раствора D (смесь А и В, 50/1),      50µl реактива Фолина,;

перемешать и ждать развития окраски 30';

измерить OD₇₅₀ (в 1ml кювете);

рассчитать концентрацию белка по калибровочной кривой

.

Спектрофотометрический метод.

Принцип метода: метод основан на способности ароматических аминокислот (триптофана, тирозина, фенилаланина) поглощать ультрафиолетовый свет с максимумом при 280 нм. Измеряя величину оптической плотности при этой длине волны, находят количество белка в растворе. Поскольку белки отличаются по содержанию ароматических аминокислот, их поглощение в ультрафиолетовой области спектра может сильно различаться. Условно считают, что при концентрации «усредненного» белка в растворе, равной 1 мг/мл, величина оптической плотности при 280 нм равна 1,0 (при толщине кюветы 1,0 см).

Определению белка данным методом мешает присутствие нуклеиновых кислот и нуклеотидов, поэтому измеряют оптическую плотность раствора при 260 нм (для учета поглощения соединений нуклеотидной природы) и 280 нм.

Реактивы:

1. стандартный раствор белка, содержащий 1-5 мг/мл.

Ход работы: в спектрофотометрическую кювету вносят стандартный раствор белка и измеряют оптическую плотность раствора при 260 нм и 280 нм. Содержание белка находят по формуле Калькара:

Содержание белка (мг/мл) = 1,45 * А₂₈₀ – 0,74 * А₂₆₀