Добавил:
Upload Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз: Предмет: Файл:
Гусейнов / Лекция 2.3.docx
Скачиваний:
87
Добавлен:
10.06.2015
Размер:
155.66 Кб
Скачать

Лекция 3.2

Эндонуклеазы рестрикции

Эндонуклеазы рестрикции, рестриктазы (от лат.restrictio — ограничение) — группа ферментов, относящихся к классу гидролаз,катализирующих гидролиз фосфодиэфирных связей чужеродных ДНК в большинстве прокариотических (бактерии и сине-зеленые водоросли) и некоторых других организмах и выполняющие тем самым "иммунную" функцию. Это ферменты, «узнающие» определенные последовательности (сайты рестрикции) в двухцепочечной ДНК. Их выделяют преимущественно из прокариотических клеток.

В отличие от экзонуклеаз, рестриктазы расщепляют нуклеиновые кислоты не с конца молекулы, а в середине. При этом каждая рестриктаза узнаёт определённый участокДНКдлиной от четырёх пар нуклеотидов и расщепляет нуклеотидную цепь внутри участка узнавания или вне его.

Еще в 1953 году было обнаружено, что ДНК определенного штамма

E. coli, введенная в клетки другого штамма (например, ДНК штамма В - в клетки штамма С) не проявляет, как правило, генетической активности, так как быстро расщепляется на мелкие фрагменты.

В 1966 году было показано, что это явление связано со специфической модификацией хозяйской ДНК - она содержит несколько метилированных оснований, отсутствующих в немодифицированной ДНК, причем метилирование (добавление к основанию метильной группы) происходит уже после завершения репликации. Бактерия способна отличить свою собственную ДНК от любой вторгающейся «чужеродной» именно по типу ее модификации. За «метку» отвечают метилирующие ферменты модификации, так называемые ДНК-метилазы. Различие в модификации делает чужеродную ДНК чувствительной к действию рестрицирующих ферментов, которые узнают отсутствие метильных групп в соответствующих сайтах.

Системы рестрикции и модификации широко распространены у бактерий; их существование играет важную роль в защите резидентной ДНК от загрязнения последовательностями чужеродного происхождения.

Рестриктаза, которая расщепляла неметилированную ДНК была выделена в 1968 г. Мезельсоном и Юанем. Этот фермент был высокоспецифичен по отношению к определенной последовательности ДНК, но расщеплял молекулы неспецифически, в другом месте, на некотором удалении от участка узнавания. Вскоре, в 1970 г. Смит и Вилькокс выделили из Haemophilus influenzae первую рестриктазу, которая расщепляла строго определенную последовательность ДНК (Hind III). Поскольку разные бактерии по-разному метят свою ДНК, то и рестриктазы должны узнавать разные последовательности. И действительно, с тех пор выделены рестриктазы, узнающие более 150 сайтов рестрикции (мест расщепления ДНК).

Защита бактериального генома от собственной рестриктазы осуществляется с помощью метилирования нуклеотидных остатков аденинаицитозина(маскированием).

  • 1 Классификация

  • 2 Изошизомеры

    • 2.1 Гетерошизомеры (неошизомеры)

    • 2.2 Изокаудомеры

Классификация

Выделяют три основных типа (или класса) ферментоврестрикции,сайты узнаваниядля которых могут быть симметричными (палиндромными) и несимметричными:

  • Рестриктазы первого типа (например, ЕсоК из Escherichia coli К12) узнают определённую последовательность нуклеотидов и разрезают двухцепочную молекулу ДНК неподалёку от этой последовательности в произвольной точке и само место разреза не строго специально (по-видимому, после образования комплекса с ДНК фермент неспецифически взаимодействует с удаленной областью ДНК или передвигается вдоль нити ДНК).

  • Рестриктазы второго типа (например, EcoRI) узнают определённую последовательность и разрезают двойную спираль ДНК в определённой фиксированной точке внутри этой последовательности. Рестриктазы этого типа узнают палиндромальные последовательности, которые обладают центральной осью и считываются одинаково в обе стороны от оси симметрии.

  • Рестриктазы третьего промежуточного типа (например, EcoPI) узнают нужную последовательность и разрезают двухцепочную молекулу ДНК, отступив определённое число нуклеотидных пар от её конца (или в нескольких точках на разном удалении от сайта узнавания). При этом образуются фрагменты ДНК либо с ровными (тупыми) концами, либо с выступающими (липкими) 5'- или 3'-концами. Эти рестриктазы узнают асимметричные сайты.

Ферменты типа I и типа III обладают модифицирующей (метилирующей) активностью и АТФ-зависимой рестриктирующей активностью (внесение разрывов), проявляемыми одним и тем же белком. Ферменты обоих типов узнают неметилированные последовательности в ДНК-субстрате, но ферменты типа I вносят случайные разрывы, в то время как ферменты типа III разрезают ДНК в специфических участках.

Системы рестрикции – модификации типа II включают два отдельных фермента: рестриктирующую эндонуклеазу и модифицирующую метилазу. Было выделено большое число ферментов рестрикции типа II, многие из которых используются в молекулярном клонировании. Эти ферменты разрезают ДНК внутри или около своих сайтов, которые обычно имеют 4-6 нуклеотидов и обладают осью симметрии 2-го порядка. Например, фермент EcoRI узнает последовательность гексануклеотидов

Подобно многим другим ферментам рестрикции, EcoRI вносит разрыв не точно по оси симметрии 2-го порядка, а в точках двух цепей ДНК, отстоящих друг от друга на 4 нуклеотида:

В результате такого разрыва образуются фрагменты ДНК с выступающими липкими 5’-концами. Каждый такой конец может взаимодействовать с любым другим концом, комплементарным ему. Таким образом, любые молекулы ДНК, содержащие сайты рестрикции, можно соединять с другими молекулами и в результате получать рекомбинантные молекулы.

Многие ферменты рестрикции, подобно EcoRI, катализируют разрывы, в результате которых образуются фрагменты ДНК с выступающими 5’-концами; под действием других (например, PstI) – с выступающими 3’-липкими концами, в то время как третьи (например, BalI) разрезают ДНК по оси симметрии с образованием фрагментов с тупыми концами.

К 2007 году выделено более трех тысяч эндонуклеаз рестрикции. Более шестисот рестриктаз доступны в виде коммерческих препаратов и повседневно используются в лабораториях для модификации ДНК и решения генно-инженерныхзадач.

Изошизомеры

Изошизомеры — это пары эндонуклеаз рестрикции, имеющих специфичность к распознаванию одинаковых последовательностей, но иногда отличающихся по наличию метилированных нуклеотидных остатков, и разрезающих эти последовательности в одинаковых местах. Например, изошизомерами являются рестриктазы Sph I (CGTAC^G) и Bbu I (CGTAC^G). Первый выделенный фермент для узнавания и специфического разрезания заданной последовательности, называют прототипом, а все остальные подобные рестриктазы называют изошизомерами.

Изошизомеры выделяют из разных штаммов бактерий и поэтому разные изошизомеры могут требовать разных условий реакции.

Гетерошизомеры (неошизомеры)

Фермент, узнающий такую же последовательность, но разрезающий её по-другому, называют гетерошизомером (неошизомером). Изошизомеры, таким образом, являются частным случаем гетерошизомеров. Например, рестриктазы Sma I (GGG^CCC) и Xma I (G^GGCCC) являются гетерошизомерами, но не изошизомерами друг для друга.

Изокаудомеры

Рестриктазы, распознающие совершенно разные последовательности, но образующие одинаковые концы, называют изокаудомерами.

Значение

Наибольшее значение имеют рестриктазы второго типа, широко применяемые в генетической инженерии и при установлении структуры ДНК. Эти ферменты, которые по мол. массе, рН оптимуму каталитической активности значительно варьируют в зависимости от источника), расщепляют обе нити ДНК. При этом разрыв осуществляет иногда одна молекула рестриктазы в обеих нитях, иногда-две молекулы фермента (каждая атакует лишь одну нить, как, напр., EcoRI). В большинстве случаев 3', 5'-фосфодиэфирные связи в ДНК расщепляются с образованием 5'-фосфатов на месте разрыва молекулы, лишь немногие рестриктазы (напр., Nсil) образуют фрагменты с 3'-фосфатными группами. Все рестриктазы второго класса-Mg2+-зависимые ферменты. Для некоторых рестриктаз (например, EcoRI) установлена первичная структура.

В практической молекулярной биологии чаще всего используются рестриктазы II типа, сайт узнавания для которых в большинстве случаев представляет собой палиндром.

Рестриктазы — часть сложной системы рестрикции-модификации, используемой бактериальными клетками для регуляции содержания и активностиДНКв клетке.

Открытие рестриктаз в 1970-хгодах вместе с разработкой способовсеквенированияДНК послужило основным толчком для развитиягенетической инженерии.

В настоящее время рестриктазы с различными сайтами узнавания являются основным инструментомгенетических исследований игенной инженерии.

Расщепление ДНК происходит обычно в пределах сайта узнавания, редко-на определенном расстоянии от него. При этом образуются фрагменты ДНК либо с ровными (тупыми) концами, либо с выступающими (липкими) 5'- или З'-концами (см. рис.).

Схема расщепления ДНК разными рестриктазами: А, С, G и Т-соотв. дезок-сиаденозин, дезоксицитидин, дезоксигуанозин и дезокситимидин; N-любой дезоксинуклеозид, ферменты; 1-HalIII, 2-EcoI, 3-BglI, 4-HgaI.

Применение рестриктаз второго класса позволяет вырезать из ДНК определенные фрагменты, а также встраивать их в заданные места векторных молекул ДНК, т. е. направленно конструировать молекулы с новой генетической, информацией.