
Гусейнов / Лекция 3.3 Ферменты, праймеры и ДНК
.docxЛекция 3.12
Эндонуклеазы рестрикции
Эндонуклеазы рестрикции, рестриктазы (от лат. restrictio — ограничение) — группа ферментов, относящихся к классу гидролаз, катализирующих гидролиз фосфодиэфирных связей чужеродных ДНК в большинстве прокариотических (бактерии и сине-зеленые водоросли) и некоторых других организмах и выполняющие тем самым "иммунную" функцию. Это ферменты, «узнающие» определенные последовательности (сайты рестрикции) в двухцепочечной ДНК. Их выделяют преимущественно из прокариотических клеток.
Примечания
Рестриктазы – дорогие ферменты! Связанные с ними затраты могут быть
сведены к минимуму, если следовать приведенным ниже правилам.
А. Чтобы отобрать небольшое количество фермента из упаковки с концентрированным раствором рестриктазы, быстро коснитесь кончиком стеклянной микропипетки разового пользования (на 5 мкл) поверхности раствора фермента. Таким способом можно отобрать всего 0,1 мкл раствора фермента.
Б. Рестриктазы стабильны при хранении при –20оС в буфере, содержащем 50% глицерин. При проведении расщепления ДНК растриктазами приготовьте реакционную смесь, содержащую все компоненты, кроме фермента. Достаньте из морозильника фермент и сразу же поместите его в лед. Работайте как можно быстрее, чтобы фермент находился вне морозильника минимальное время. Сразу же после использования поместите фермент обратно в морозильник.
В. Используйте минимальные объемы реакционной смеси, уменьшая в ней
количество воды, насколько это возможно. Проверьте, однако, чтобы объем внесенной рестриктазы составлял менее 1/10 конечного объема реакционной смеси, иначе активность фермента может ингибироваться глицерином.
Г. Когда ДНК необходимо обработать двумя или более рестриктазами, реакцию можно проводить одновременно при условии, что оба фермента функционируют в одном и том же буфере. В противном случае первым следует использовать фермент, функционирующий в буфере с более низкой ионной силой. После этого в реакционную смесь можно добавить необходимое количество соли и второй фермент (ферменты) и продолжить инкубацию.
Краткое описание некоторых ферментов рестрикции
Название |
Aat II |
Сайт узнавания |
GACGT↑C C↓TGCAG |
|||||||||||||||
Источник |
Из штамма E.coli несущего клонированный ген Aat II из Acetobacter aceti |
|||||||||||||||
Субстрат для определения активности |
ДНК фага лямбда |
|||||||||||||||
Единица активности |
За единицу активности принимается количество фермента, необходимое для гидролиза 1 мкг ДНК фага лямбда за 1 час при 37°С в 50 мкл реакционной смеси. |
|||||||||||||||
Оптимальный SE-буфер |
Y (33 mM Tris-ацетат (pH 7.9 при 25°C); 10 mM магний-ацетат; 66 mM калий-ацетат; 1 mM DTT.) |
|||||||||||||||
Активность фермента в различных буферах в процентах от максимальной: |
|
|||||||||||||||
Оптимальная температура |
37oC |
|||||||||||||||
Условия хранения |
10 mM Tris-HCl (pH 7.5); 50 mM NaCl; 0.1 mM EDTA; 200 ug/ml BSA; 1 mM DTT; 50% глицерин; Хранить при -20°С. Срок хранения фермента 1 год с даты проверки, указанной на фасовке |
|||||||||||||||
Лигирование |
После гидролиза 10-кратным избытком фермента более 90% фрагментов ДНК сшиваются ДНК-лигазой и могут быть повторно расщеплены. |
|||||||||||||||
Неспецифический гидролиз |
Картина специфического гидролиза не изменяется при обработке 1 мкг ДНК 10 ед фермента в течение 16 часов при 37°С. |
|||||||||||||||
Чувствительность к метилированию |
не проверялось |
|||||||||||||||
Инактивация 20 мин при |
65oC |
|||||||||||||||
Литература: |
Sugisaki H., Maekawa Y., Kanazawa S., Takanami M. Nucleic Acid Res. 10:5747-5752(1982) |
|||||||||||||||
Теоретические электрофореграммы разделения фрагментов ДНК в 1%-ном агарозном геле 1хТБЕ для наиболее популярных плазмидных и вирусных ДНК: Длины фрагментов на дорожке 13273, 10739, 9980, 1945 ДНК аденовируса-2 |
|
Название |
|
Сайт узнавания |
G↑ANTC CTNA↓G |
||||||||||
Источник |
Из штамма E.coli несущего клонированный ген HinfI из Haemophilus influenzae |
||||||||||
Субстрат для определения активности |
ДНК фага лямбда |
||||||||||
Единица активности |
За единицу активности принимается количество фермента, необходимое для гидролиза 1 мкг ДНК фага лямбда за 1 час при 37°С в 50 мкл реакционной смеси. |
||||||||||
Оптимальный SE-буфер |
O (50 mM Tris-HCl (pH 7.6 при 25°C); 10 mM MgCl2; 100 mM NaCl; 1 mM DTT.) |
||||||||||
Активность фермента в различных буферах в процентах от максимальной: |
|
||||||||||
Оптимальная температура |
37oC |
||||||||||
Условия хранения |
10 mM Tris-HCl (pH 7.5); 50 mM NaCl; 0,1 mM EDTA; 1 mM DTT; 200 μg/ml BSA; 50% глицерин; Хранить при -20°С. Срок хранения фермента 1 год с даты проверки, указанной на фасовке |
||||||||||
Лигирование |
После гидролиза 20-кратным избытком фермента более 90% фрагментов ДНК сшиваются ДНК-лигазой и могут быть повторно расщеплены. |
||||||||||
Неспецифический гидролиз |
Картина специфического гидролиза не изменяется при обработке 1 мкг ДНК 40 ед фермента в течение 16 часов при 37°С. |
||||||||||
Чувствительность к метилированию |
не проверялось |
||||||||||
Инактивация 20 мин при |
80oC |
||||||||||
Примечание |
С ферментом поставляется 10 Х SE-буфер O. |
Название |
|
Сайт узнавания |
A↑AGCTT TTCGA↓A |
|
|||||||||||||||
Источник |
Из штамма E.coli несущего клонированный ген HindIII из Haemophilus influenzae Rd |
||||||||||||||||
Субстрат для определения активности |
ДНК фага лямбда |
||||||||||||||||
Единица активности |
За единицу активности принимается количество фермента, необходимое для гидролиза 1 мкг ДНК фага лямбда за 1 час при 37°С в 50 мкл реакционной смеси. |
||||||||||||||||
Оптимальный SE-буфер |
W (10 mM Tris-HCl (pH 8.5 при 25°C); 10 mM MgCl2; 100 mM NaCl; 1 mM DTT.) + BSA |
||||||||||||||||
Активность фермента в различных буферах в процентах от максимальной: |
|
||||||||||||||||
Оптимальная температура |
37oC |
||||||||||||||||
Условия хранения |
10 mM Tris-HCl (pH 7.5); 250 mM NaCl; 0.1 mM EDTA; 200 μg/ml BSA; 7 mM 2-меркаптоэтанол; 50% глицерин; Хранить при -20°С. Срок хранения фермента 1 год с даты проверки, указанной на фасовке |
||||||||||||||||
Лигирование |
После гидролиза 50-кратным избытком фермента более 90% фрагментов ДНК сшиваются ДНК-лигазой и могут быть повторно расщеплены. |
||||||||||||||||
Неспецифический гидролиз |
Картина специфического гидролиза не изменяется при обработке 1 мкг ДНК 40 ед фермента в течение 16 часов при 37°С. |
||||||||||||||||
Чувствительность к метилированию |
не проверялось |
||||||||||||||||
Инактивация 20 мин при |
80oC |
||||||||||||||||
Примечание |
Для достижения 100% активности BSA следует добавлять в реакционную смесь до концентрации 100 мкг/мл. С ферментом поставляется 10 Х SE-буфер W, BSA. |
||||||||||||||||
Литература: |
Old,
R., Murray, K., Roizes, G. J. Mol. Biol. 92: 331-339 (1975).
|
||||||||||||||||
Теоретические электрофореграммы разделения фрагментов ДНК в 1%-ном агарозном геле 1хТБЕ для наиболее популярных плазмидных и вирусных ДНК: Длины фрагментов на дорожке 15000, 10000, 9000, 8000, 7000, 6000, 5000, 4000, 3000, 2000, 1000 Маркер
|
|
|
Название |
|
||||||||||||||||
Сайт узнавания |
G↑AATTC CTTAA↓G |
||||||||||||||||
Источник |
Из штамма E.coli несущего клонированный ген EcoR I из Escherichia coli |
||||||||||||||||
Субстрат для определения активности |
ДНК фага лямбда |
||||||||||||||||
Единица активности |
За единицу активности принимается количество фермента, необходимое для гидролиза 1 мкг ДНК фага лямбда за 1 час при 37°С в 50 мкл реакционной смеси. |
||||||||||||||||
Оптимальный SE-буфер |
SE-буфер EcoRI (100 mM Tris-HCl (pH 7.6 при 25°C); 10 mM MgCl2; 50 mM NaCl; 1 mM DTT.) + BSA |
||||||||||||||||
Активность фермента в различных буферах в процентах от максимальной: |
|
||||||||||||||||
Оптимальная температура |
37oC |
||||||||||||||||
Условия хранения |
10 mM Tris-HCl (pH 7.5); 200 mM NaCl; 0.1 mM EDTA; 7 mM 2-меркаптоэтанол; 200 μg/ml BSA; 50% глицерин; Хранить при -20°С. Срок хранения фермента 1 год с даты проверки, указанной на фасовке |
||||||||||||||||
Лигирование |
После гидролиза 40-кратным избытком фермента более 90% фрагментов ДНК сшиваются ДНК-лигазой и могут быть повторно расщеплены. |
||||||||||||||||
Неспецифический гидролиз |
Картина специфического гидролиза не изменяется при обработке 1 мкг ДНК 40 ед фермента в течение 16 часов при 37°С. |
||||||||||||||||
Чувствительность к метилированию |
не проверялось |
||||||||||||||||
Инактивация 20 мин при |
65oC |
||||||||||||||||
Примечание |
При большом избытке фермента, при использовании неоптимального буфера возможно появление звездчатой активности. Длительная инкубация c BSA не рекомендуется из-за появления звездчатой активности. Для достижения 100% активности BSA следует добавлять в реакционную смесь до концентрации 100 мкг/мл. С ферментом поставляется 10 Х SE-буфер EcoRI, BSA. |
||||||||||||||||
Литература: |
Albertsen,
H.M., Le Paslier, D., Abderrahim, H., Dausset, J., Cann, H.,
Cohen, D. Nucleiv Acids Res. 17: 808 (1989).
|
||||||||||||||||
Теоретические электрофореграммы разделения фрагментов ДНК в 1%-ном агарозном геле 1хТБЕ для наиболее популярных плазмидных и вирусных ДНК: Длины фрагментов на дорожке 15000, 10000, 9000, 8000, 7000, 6000, 5000, 4000, 3000, 2000, 1000 Маркер
|
M - маркер, 1 - ДНК аденовируса-2, 2 - ДНК фага Лямбда, 3 - ДНК фага T7, 4 - pUC19, 5 - pBR322
|
Название |
|
Сайт узнавания |
G↑GATCC CCTAG↓G |
||||||||||||||
Источник |
Из штамма E.coli несущего клонированный ген BamHI из Bacillus amyloliquefaciens H |
||||||||||||||
Субстрат для определения активности |
ДНК фага лямбда |
||||||||||||||
Единица активности |
За единицу активности принимается количество фермента, необходимое для гидролиза 1 мкг ДНК фага лямбда за 1 час при 37°С в 50 мкл реакционной смеси. |
||||||||||||||
Оптимальный SE-буфер |
G (10 mM Tris-HCl (pH 7.6 при 25°C); 10 mM MgCl2; 50 mM NaCl; 1 mM DTT.) + BSA |
||||||||||||||
Активность фермента в различных буферах в процентах от максимальной: |
|
||||||||||||||
Оптимальная температура |
37oC |
||||||||||||||
Условия хранения |
10 mM Tris-HCl (pH 7.6); 50 mM NaCl; 0.1 mM EDTA; 100 μg/ml BSA; 1mM DTT; 50% глицерин; Хранить при -20°С. Срок хранения фермента 1 год с даты проверки, указанной на фасовке |
||||||||||||||
Лигирование |
После гидролиза 50-кратным избытком фермента более 90% фрагментов ДНК сшиваются ДНК-лигазой и могут быть повторно расщеплены. |
||||||||||||||
Неспецифический гидролиз |
Картина специфического гидролиза не изменяется при обработке 1 мкг ДНК 40 ед фермента в течение 16 часов при 37°С. |
||||||||||||||
Чувствительность к метилированию |
Не блокируется при перекрывании dam-метилированием (GmATC) : GGATCC. |
||||||||||||||
Инактивация 20 мин при |
65oC |
||||||||||||||
Примечание |
Большой избыток фермента приводит к появлению звездчатой активности. Для достижения 100% активности BSA следует добавлять в реакционную смесь до концентрации 100 мкг/мл. С ферментом поставляется 10 Х SE-буфер G, BSA. |
||||||||||||||
Литература: |
Wilson, G.A. and Young, F.E. J. Mol. Biol. 97: 123-125 (1975). Roberts, R.J., Wilson, G.A., Young, F.E. Nature 265: 82-84 (1977) |
||||||||||||||
Теоретические электрофореграммы разделения фрагментов ДНК в 1%-ном агарозном геле 1хТБЕ для наиболее популярных плазмидных и вирусных ДНК: Длины фрагментов на дорожке 15000, 10000, 9000, 8000, 7000, 6000, 5000, 4000, 3000, 2000, 1000 Маркер
|
M - маркер, 1 - ДНК аденовируса-2, 2 - ДНК фага Лямбда, 3 - ДНК фага T7, 4 - pUC19, 5 - pBR322 |
Теоретические электрофореграммы разделения фрагментов ДНК в 1%-ном агарозном геле 1хТБЕ для наиболее популярных плазмидных и вирусных ДНК: Длины фрагментов на дорожке 16841, 7233, 6771, 6527, 5626, 5504 ДНК фага Лямбда
|
M - маркер, 1 - ДНК аденовируса-2, 2 - ДНК фага Лямбда, 3 - ДНК фага T7, 4 - pUC19, 5 - pBR322 |