Гусейнов / Лекция 3.3 Ферменты, праймеры и ДНК

Название

Aat II

Сайт узнавания

GACGT↑C C↓TGCAG

Источник

Из штамма E.coli несущего клонированный ген Aat II из Acetobacter aceti

Субстрат для определения активности

ДНК фага лямбда

Единица активности

За единицу активности принимается количество фермента, необходимое для гидролиза 1 мкг ДНК фага лямбда за 1 час при 37°С в 50 мкл реакционной смеси.

Оптимальный SE-буфер

Y (33 mM Tris-ацетат (pH 7.9 при 25°C); 10 mM магний-ацетат; 66 mM калий-ацетат; 1 mM DTT.)

Активность фермента в различных буферах в процентах от максимальной:

Оптимальная температура

37^oC

Условия хранения

10 mM Tris-HCl (pH 7.5); 50 mM NaCl; 0.1 mM EDTA; 200 ug/ml BSA; 1 mM DTT; 50% глицерин; Хранить при -20°С. Срок хранения фермента 1 год с даты проверки, указанной на фасовке

Лигирование

После гидролиза 10-кратным избытком фермента более 90% фрагментов ДНК сшиваются ДНК-лигазой и могут быть повторно расщеплены.

Неспецифический гидролиз

Картина специфического гидролиза не изменяется при обработке 1 мкг ДНК 10 ед фермента в течение 16 часов при 37°С.

Чувствительность к метилированию

не проверялось

Инактивация 20 мин при

65^oC

Литература:

Sugisaki H., Maekawa Y., Kanazawa S., Takanami M. Nucleic Acid Res. 10:5747-5752(1982)

Теоретические электрофореграммы разделения фрагментов ДНК в 1%-ном агарозном геле 1хТБЕ для наиболее популярных плазмидных и вирусных ДНК:

Длины фрагментов на дорожке

13273, 10739, 9980, 1945

ДНК аденовируса-2

Название

Сайт узнавания

G↑ANTC CTNA↓G

Источник

Из штамма E.coli несущего клонированный ген HinfI из Haemophilus influenzae

Субстрат для определения активности

ДНК фага лямбда

Единица активности

За единицу активности принимается количество фермента, необходимое для гидролиза 1 мкг ДНК фага лямбда за 1 час при 37°С в 50 мкл реакционной смеси.

Оптимальный SE-буфер

O (50 mM Tris-HCl (pH 7.6 при 25°C); 10 mM MgCl₂; 100 mM NaCl; 1 mM DTT.)

Активность фермента в различных буферах в процентах от максимальной:

Оптимальная температура

37^oC

Условия хранения

10 mM Tris-HCl (pH 7.5); 50 mM NaCl; 0,1 mM EDTA; 1 mM DTT; 200 μg/ml BSA; 50% глицерин; Хранить при -20°С. Срок хранения фермента 1 год с даты проверки, указанной на фасовке

Лигирование

После гидролиза 20-кратным избытком фермента более 90% фрагментов ДНК сшиваются ДНК-лигазой и могут быть повторно расщеплены.

Неспецифический гидролиз

Картина специфического гидролиза не изменяется при обработке 1 мкг ДНК 40 ед фермента в течение 16 часов при 37°С.

Чувствительность к метилированию

не проверялось

Инактивация 20 мин при

80^oC

Примечание

С ферментом поставляется 10 Х SE-буфер O.

Название

Сайт узнавания

A↑AGCTT TTCGA↓A

Источник

Из штамма E.coli несущего клонированный ген HindIII из Haemophilus influenzae Rd

Субстрат для определения активности

ДНК фага лямбда

Единица активности

За единицу активности принимается количество фермента, необходимое для гидролиза 1 мкг ДНК фага лямбда за 1 час при 37°С в 50 мкл реакционной смеси.

Оптимальный SE-буфер

W (10 mM Tris-HCl (pH 8.5 при 25°C); 10 mM MgCl₂; 100 mM NaCl; 1 mM DTT.) + BSA

Активность фермента в различных буферах в процентах от максимальной:

Оптимальная температура

37^oC

Условия хранения

10 mM Tris-HCl (pH 7.5); 250 mM NaCl; 0.1 mM EDTA; 200 μg/ml BSA; 7 mM 2-меркаптоэтанол; 50% глицерин; Хранить при -20°С. Срок хранения фермента 1 год с даты проверки, указанной на фасовке

Лигирование

После гидролиза 50-кратным избытком фермента более 90% фрагментов ДНК сшиваются ДНК-лигазой и могут быть повторно расщеплены.

Неспецифический гидролиз

Картина специфического гидролиза не изменяется при обработке 1 мкг ДНК 40 ед фермента в течение 16 часов при 37°С.

Чувствительность к метилированию

не проверялось

Инактивация 20 мин при

80^oC

Примечание

Для достижения 100% активности BSA следует добавлять в реакционную смесь до концентрации 100 мкг/мл. С ферментом поставляется 10 Х SE-буфер W, BSA.

Литература:

Old, R., Murray, K., Roizes, G. J. Mol. Biol. 92: 331-339 (1975).  В.А. Чернухин, М.А. Абдурашитов, В.Н. Томилов, Д.А. Гончар, С.Х. Дегтярев Сравнительный рестрикционный анализ хромосомной ДНК крысы in vitro и in silico // Вестник биотехнологии и физико-химической биологии имени Ю. А. Овчинникова, 2006, т. 2, №3, с. 39-46

Теоретические электрофореграммы разделения фрагментов ДНК в 1%-ном агарозном геле 1хТБЕ для наиболее популярных плазмидных и вирусных ДНК:

Длины фрагментов на дорожке

15000, 10000, 9000, 8000, 7000, 6000, 5000, 4000, 3000, 2000, 1000

Маркер

Название

Сайт узнавания

G↑AATTC CTTAA↓G

Источник

Из штамма E.coli несущего клонированный ген EcoR I из Escherichia coli

Субстрат для определения активности

ДНК фага лямбда

Единица активности

За единицу активности принимается количество фермента, необходимое для гидролиза 1 мкг ДНК фага лямбда за 1 час при 37°С в 50 мкл реакционной смеси.

Оптимальный SE-буфер

SE-буфер EcoRI (100 mM Tris-HCl (pH 7.6 при 25°C); 10 mM MgCl₂; 50 mM NaCl; 1 mM DTT.) + BSA

Активность фермента в различных буферах в процентах от максимальной:

Оптимальная температура

37^oC

Условия хранения

10 mM Tris-HCl (pH 7.5); 200 mM NaCl; 0.1 mM EDTA; 7 mM 2-меркаптоэтанол; 200 μg/ml BSA; 50% глицерин; Хранить при -20°С. Срок хранения фермента 1 год с даты проверки, указанной на фасовке

Лигирование

После гидролиза 40-кратным избытком фермента более 90% фрагментов ДНК сшиваются ДНК-лигазой и могут быть повторно расщеплены.

Неспецифический гидролиз

Картина специфического гидролиза не изменяется при обработке 1 мкг ДНК 40 ед фермента в течение 16 часов при 37°С.

Чувствительность к метилированию

не проверялось

Инактивация 20 мин при

65^oC

Примечание

При большом избытке фермента, при использовании неоптимального буфера возможно появление звездчатой активности. Длительная инкубация c BSA не рекомендуется из-за появления звездчатой активности. Для достижения 100% активности BSA следует добавлять в реакционную смесь до концентрации 100 мкг/мл. С ферментом поставляется 10 Х SE-буфер EcoRI, BSA.

Литература:

Albertsen, H.M., Le Paslier, D., Abderrahim, H., Dausset, J., Cann, H., Cohen, D. Nucleiv Acids Res. 17: 808 (1989).  В.А. Чернухин, М.А. Абдурашитов, В.Н. Томилов, Д.А. Гончар, С.Х. Дегтярев Сравнительный рестрикционный анализ хромосомной ДНК мыши in vitro и in silico // Вестник биотехнологии и физико-химической биологии имени Ю. А. Овчинникова, 2007, 3, №4, с. 19-27.  В.А. Чернухин, М.А. Абдурашитов, В.Н. Томилов, Д.А. Гончар, С.Х. Дегтярев Сравнительный рестрикционный анализ хромосомной ДНК крысы in vitro и in silico // Вестник биотехнологии и физико-химической биологии имени Ю. А. Овчинникова, 2006, т. 2, №3, с. 39-46

Теоретические электрофореграммы разделения фрагментов ДНК в 1%-ном агарозном геле 1хТБЕ для наиболее популярных плазмидных и вирусных ДНК:

Длины фрагментов на дорожке

15000, 10000, 9000, 8000, 7000, 6000, 5000, 4000, 3000, 2000, 1000

Маркер

M - маркер, 1 - ДНК аденовируса-2, 2 - ДНК фага Лямбда, 3 - ДНК фага T7, 4 - pUC19, 5 - pBR322

Название

Сайт узнавания

G↑GATCC CCTAG↓G

Источник

Из штамма E.coli несущего клонированный ген BamHI из Bacillus amyloliquefaciens H

Субстрат для определения активности

ДНК фага лямбда

Единица активности

За единицу активности принимается количество фермента, необходимое для гидролиза 1 мкг ДНК фага лямбда за 1 час при 37°С в 50 мкл реакционной смеси.

Оптимальный SE-буфер

G (10 mM Tris-HCl (pH 7.6 при 25°C); 10 mM MgCl₂; 50 mM NaCl; 1 mM DTT.) + BSA

Активность фермента в различных буферах в процентах от максимальной:

Оптимальная температура

37^oC

Условия хранения

10 mM Tris-HCl (pH 7.6); 50 mM NaCl; 0.1 mM EDTA; 100 μg/ml BSA; 1mM DTT; 50% глицерин; Хранить при -20°С. Срок хранения фермента 1 год с даты проверки, указанной на фасовке

Лигирование

После гидролиза 50-кратным избытком фермента более 90% фрагментов ДНК сшиваются ДНК-лигазой и могут быть повторно расщеплены.

Неспецифический гидролиз

Картина специфического гидролиза не изменяется при обработке 1 мкг ДНК 40 ед фермента в течение 16 часов при 37°С.

Чувствительность к метилированию

Не блокируется при перекрывании dam-метилированием (G^mATC) : GGATCC.

Инактивация 20 мин при

65^oC

Примечание

Большой избыток фермента приводит к появлению звездчатой активности. Для достижения 100% активности BSA следует добавлять в реакционную смесь до концентрации 100 мкг/мл. С ферментом поставляется 10 Х SE-буфер G, BSA.

Литература:

Wilson, G.A. and Young, F.E. J. Mol. Biol. 97: 123-125 (1975). Roberts, R.J., Wilson, G.A., Young, F.E. Nature 265: 82-84 (1977)

Теоретические электрофореграммы разделения фрагментов ДНК в 1%-ном агарозном геле 1хТБЕ для наиболее популярных плазмидных и вирусных ДНК:

Длины фрагментов на дорожке

15000, 10000, 9000, 8000, 7000, 6000, 5000, 4000, 3000, 2000, 1000

Маркер

M - маркер, 1 - ДНК аденовируса-2, 2 - ДНК фага Лямбда, 3 - ДНК фага T7, 4 - pUC19, 5 - pBR322

Теоретические электрофореграммы разделения фрагментов ДНК в 1%-ном агарозном геле 1хТБЕ для наиболее популярных плазмидных и вирусных ДНК: Длины фрагментов на дорожке

16841, 7233, 6771, 6527, 5626, 5504

ДНК фага Лямбда

M - маркер, 1 - ДНК аденовируса-2, 2 - ДНК фага Лямбда, 3 - ДНК фага T7, 4 - pUC19, 5 - pBR322