Подготовка у универсиаде 2012 / Генетика (Жимулев) / 13ver7
.pdf
Политенные хромосомы |
Глава 13 |
|
|
В-третьих, сформировавшиеся политенныехромосомынеспособнывступать вмитотическиеделения.
В-четвертых, ядерная оболочка и ядрышко остаются интактными в ходе следующиходинзаоднимцикловрепликации ДНК.
Политения возникает и достигает высокихстепенейвтканях,органахилинатех стадиях развития, когда есть необходимость быстрогоростаорганапринеизменновысоком уровне функционирования. Органы, содержащие клетки с политенными хромосомами, как правило вовлечены в процессы интенсивной секреции, осуществляемыевтечениекороткоговремени нафонебыстрогороста.Таковыпитающие клетки ооцитов,глоточные, шелкоотделительные, слюнные железы, трофобласт,антиподы,гаусторий,суспензор, эндосперм.Особенностиполитениисоздают предпосылкидлявыполненияэтихфункций. Поскольку в клеточном цикле полностью блокирован весь механизм деления ядра и клетки, процесс редупликации хромосом максимальноупрощениускорен.Врезультате засчетполитенизациимассаоргананарастает значительно быстрее, чем за счет митотических делений диплоидных клеток. Очевиднотакже,чтоклеточныйциклпотипу политенииспособствуетсохранениювысокой функциональнойактивностиоргана,таккакнет перерывов,связанныхсмитозами.
Политения найдена у организмов, появлявшихся на всех этапах эволюции, например у инфузорий, появившихся еще в Докембрийскуюэру,более600млн.летназад, а затем политения возникала вместе с появлениеммоллюсковичервей(Докембрий), ногохвосток (Девон), - более 400 млн. лет назад, крылатых насекомых (Карбон-Триас), двудольных(Юра)иоднодольныхрастенийи млекопитающих(Мел-100млн.летназад).
Литература к разделу 13.7.
Жимулев И.Ф. Политенные хромосомы: морфология и структура. Новосибирск, Наука, 332 -334, 1992
13.8. Генетическая организация политенных хромосом
13.8.1. Диски
Распределение транскрипционно активныхрайоноввполитенныххромосомах изучали с помощью многих методов: специфических окрасок на РНК, световой и ЭМ авторадиографии после включения !H- уридина, локализации РНП-продуктов транскрипции,выявлениягибридовДНК/РНК. Транскрипционно-активными в политенных хромосомах являются все структуры, обнаруживающие ту или иную степень декомпактизации:пуфы,разрыхленныедиски, КольцаБальбиани,ядрышки,сбольшойдолей вероятности - междиски. Поэтому генетическая организация этих структур представляетсущественныйинтерес.
В 1970 - 1980-е годы в генетике была бурнаядискуссияогенетическомсодержании хромомера.
Фиксированноерасположениедискови междисковых участков в политенной хромосомедрозофилынавелоцитогенетиков на мысль, что каждый диск, возможно, соответствует отдельному гену.
Основная масса исследователей полагала, что каждый хромомер содержит только один ген. Были и редкие оппоненты этой идеологии, доказывавшие идею о полигеннойорганизациидисков.
Последующиеэкспериментызаставили усомниться в правильности гипотезы “один диск - один ген”. Были клонированы многочисленные области генома дрозофилы длинойотнесколькихдесятковдонескольких сотен тысяч пар нуклеотидов. Затем отдельные фрагменты этих областей использовали в качестве зондов для идентификации матричных РНК (мРНК), синтезирующихся в данном участке. Этот метод позволяет выявить участки, кодирующиемРНКнафизическойкартеДНК, т.е. фактически, гены. Как оказалось, число отдельных мРНК в три-пять раз превышает число дисков.
321
Глава 13 |
Политенные хромосомы |
|
|
|
|
По современным представлениям |
другие гены обнаружены по их активности в |
|
число генов, уже найденных у дрозофилы, |
синтезе РНК. Некоторые отрезки ДНК, |
|
составляет около 6.8 тыс. что заметно |
входящейвсоставдиска10А1-2(см.Рис.13.9г), |
|
больше, чем число дисков. Число еще |
обогащены повторами, т.е. одинаковыми |
|
неоткрытых генов по разным оценкам |
последовательностями |
нуклеотидов, |
составляет 5-10 тыс. Эти данные |
встречающимисявгеномедесяткиисотнираз. |
|
свидетельствуют о том, что генов |
Повторы,найденныевдиске10А1-2,характерны |
|
существенно больше, чем дисков, и каждый |
только для половой Х-хромосомы. Они |
|
диск должен содержать в среднем несколько |
расположены гнездами по несколько копий |
|
генов. |
подряд,иэтигнездараспределенывдольподлине |
|
То же самое вытекает из рассуждений |
Х-хромосомыпримерновдвухдесяткахрайонов. |
|
другого рода. Количество ДНК, входящей в |
Рольэтихповторовневыяснена. |
|
составодногодиска,варьируетвхромосомах |
Можнобылобыпредположить,какэтои |
|
разных видов и в хромосомах одного и того |
делали многие генетики, что гены, |
|
же вида в пределах от 5 до 200 т.п.н., и |
расположенные в одном диске, участвуют в |
|
составляет в среднем 30 т.п.н. В то же время |
осуществлениикакой-тооднойфункции,илиони |
|
генывмолекулеДНКзанимают, какправило, |
находятся под общим контролем, т.е. |
|
более короткие отрезки. В диске 10A1-2, |
функционируюткоординированно.Однако,это |
|
клонированныйрайондлиной190т.п.н.содержит |
оказалось не так. На рисунке 13.9д показаны |
|
почти25геновикДНК,т.е.одингенна7.6т.п.н. |
точкиразрывовмногочисленныххромосомных |
|
Средняяплотностьврайонегенныхклмплексов |
перестроек, таких как инверсии, делеции и |
|
achaete-scuteиBroadсоставляет1генна8т.п.н. |
транслокации.Сихпомощьючастьматериала |
|
В результате полного определения |
дискаможетбытьперенесена вдругое место в |
|
последовательности нуклеотидов в участке |
этойжехромосомеиливдругиехромосомы,или |
|
ДНКдлиной2700т.п.н.,выделеннойизрайона |
даже удалена. В результате одна группа генов |
|
34C4-36A2 второй хромосомы дрозофилы, |
дискапереноситсявсоседствосдругимигенами, |
|
проведенноговлабораторииДж.Рубинав1998 |
и целостность генной группировки диска |
|
году,показано,чтоплотностьгеновсоставляет |
нарушается. Однако это не отражается на их |
|
1 на 13.7 т.п.н. Эти данные свидетельствуют о |
активности:дажебудучиразобщенными,всегены |
|
том, что средний диск должен содержать 3-5 |
диска функционируют нормально. Еще |
|
генов. |
интереснееоказалисьрезультатыэволюционного |
|
Молекулярный и генетический анализ |
исследования диска 10А1-2. Клонированные |
|
показал, что есть диски с очень большим |
последовательности ДНК, составляющие этот |
|
числом генов, например, блоки из 160-200 |
диск у D. melanogaster - основного объекта |
|
идентичных последовательностей генов 5S |
исследований,быликартированывхромосомах |
|
pРНК,каждаядлиной385п.н.,занимаютгруппу |
у других видов эволюционно разошедшихся |
|
из 4x дисков. Сотни копий генов 18S и 28S |
около10млн.летназад:уD.virilis,D.repleta,D. |
|
рибосомнойРНКлокализованывядрышковом |
hydei.УэтихвидовДНКдиска10А1-2оказалась |
|
организаторе, который у многих видов |
представленнойвдвухнезависимыхдискахХ- |
|
двукрылых выглядит как одиночный диск. |
хромосомы:ДНКдискамеждувторойитретьей |
|
Аналогичным образом организованы диски, |
стрелками слева на Рис. 13.9з у этих видов |
|
содержащие многочисленные копии генов |
локализованаводном(тонком)диске,аДНКиз |
|
гистонов. |
районамеждутретьейичетв¸ртойстрелками-в |
|
Единственное проведенное до сих пор |
другом (более толстом) диске. Таким образом |
|
генетическое и молекулярное исследование |
нормально работающая |
группа генов, |
индивидуального диска (Рис. 13.9) показало |
заключенных в одном диске уD. melanogaster, |
|
наличие в нем около 25 генов (см. выше). |
также нормально работает в составе разных |
|
Часть из них выявляется с помощью мутаций, |
дисковудругихвидов.Всеэтосвидетельствует |
|
322
Политенные хромосомы |
Глава 13 |
|
|
оботсутствиифункциональнойсцепленности различныхгенов,входящихвсоставдиска.
Оригинальный подход к исследованию организациидисковдаетметодтрансформации, использованиекоторогопозволяетвстраивать в геном фрагменты ДНК с известными м о л е к у л я р н о - г е н е т и ч е с к и м и характеристиками.
маркерныегенынормальнофункционируют,а гены теплового шока легко активируются с образованием пуфа. Эти факты позволяют сделатьследующиеважныевыводы:
1. Поскольку из разнородной в функциональном смысле ДНК образуется единственный диск, очевидно, что вся ДНК подвергается сплошной компактизации, без
Âсостав трансформирующих диск-междисковогорисунка.Этоозначает,что
конструкций входят различные фрагменты ДНК: мобильного P-элемента, маркерные гены (rosy, Adh, гены теплового шока, B- галактозидаза E. coli), экспрессирующиеся геныДНКплазмиды.
СогласноданнымЭМанализа, в10из13 изученных районов, в котором произошла инсерция,образуетсяпоодномуновомудиску, возникшему из ДНК транспозона. Последовательности ДНК, заключенные в таких искусственных дисках, полностью сохраняют функциональную активность:
расположениегенавобеихструктурах(диски междиск) не является необходимым и диски функциональнонесвязанысмеждисками,т.е. нет оснований говорить о цитогенетической единице,состоящейиздискаимеждиска.Если внормальнойполитеннойхромосомекакой-то из генов, например, rosy был бы связан с прилежащиммеждиском,иэтасвязьбылабы функционально необходимой, то в составе трансформирующей конструкции рядом с компактной ДНК гена rosy должен был бы возникнуть междиск. Аналогичные
Рисунок 13.9 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||
|
fliG fs(1)BP2 |
|
|
v |
l(1)10Aa |
|
|
|
|
|
sev |
|
|
l(1)10Ac |
||
à |
|
l(1)9Fe |
|
|
|
|
|
|
|
ms(1)BP6 slm |
l(1)10Ad l(1)10Ae |
|||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
á |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
â |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
ã |
|
|
|
|
|
* |
|
* |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
L3 |
M6 |
L2 |
K1 |
B149 |
K9 |
M1 |
203C10 L2 |
M6 |
Iv219 |
64f29 17Cc8 |
P1 |
L1 |
L3 |
||
ä |
|
|
65b |
M5 |
P22 |
L4 |
Tv |
M5 |
P1 |
B105 |
m |
L7 |
|
|
|
|
|
|
|
L1 |
P16,P22 |
|
|
|
P16 |
L15 |
w |
|
|
|
RA37 |
||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
59D3 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
å |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
9F10-11 |
9F12 |
9F13 |
|
|
|
|
10A1-2 |
|
|
|
|
10A3 |
10A8 |
||
æ |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
ç |
0 |
|
50 |
|
100 |
|
|
150 |
|
200 |
|
250 |
|
|
300 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Молекулярно-генетическая организация диска 10А1-2 политенной хромосомы дрозофилы (Из: Жимул¸в, 1994, стр. 126).
а - гены выявляемые с помощью мутаций; б - гены, выявленные по локализации матричных РНК; г - повторенные участки ДНК; д - вертикальные линии с флажками указывают точку разрыва ДНК хромосомнымиперестройками,стрелкафлажка-направлениеперестройки;наРис.“е”изображены диски (9F10-10A8) изучаемого района; ниже (ж) показана физическая карта ДНК (от 0 до 300 тысяч пар нуклеотидов). Границы дисков соответствуют протяженности ДНК, входящей в тот или иной диск.Например,диск10А1-2занимаетоколо180т.п.н.;з-стрелкамиуказаныточки“эволюционных” разрывов ДНК у близких видов: D. virilis, D. repleta, D. hydei.
323
Глава 13 |
|
|
|
|
|
|
|
Политенные хромосомы |
||
|
|
|
||||||||
рассуждения справедливы и по отношению |
зонда для поиска клона ДНК, содержащей |
|||||||||
к другим генам, а раз так, то в результате |
полноразмерный междиск. |
|
||||||||
трансформации на месте инсерции должна |
|
Последовательности нуклеотидов |
||||||||
была возникнуть серия дисков и междисков |
междиска |
были секвенированы и |
||||||||
в соответствии с числом генетических |
проанализированы по компьютерным |
|||||||||
единиц в инсерции. Однако этого не |
программам. Оказалось, что фрагмент ДНК, |
|||||||||
наблюдается. |
|
|
|
|
длиной 1289 п.н. и заключающий в себе |
|||||
|
2. Все гены, взятые из разных дисков и |
материал междиска, имеет следующие |
||||||||
междисков, и даже из ДНК E. coli, |
особенности (Рис. 13.10): |
|
||||||||
находящиеся в инсерции, компактизуются в |
1.Являетсяуникальным, поскольку в геноме |
|||||||||
одиндиск,значитмеханизмыкомпактизации |
нет других фрагментов, гомологичных ДНК |
|||||||||
неспецифичны для разных генов. |
междиска. |
|
|
|||||||
|
|
|
|
|
|
2.Обогащен(53,4%)АТ-параминуклеотидов |
||||
13.8.2. Междиски |
|
|
3. В его пределах найдено 14 мотивов |
|||||||
|
Участки |
политенных |
хромосом, |
различных регуляторных элементов и две |
||||||
расположенные |
между |
|
дисками |
перекрывающиеся рамки считывания, одна |
||||||
(хромомерами), называют междисками |
длиной 555 п.н., другая 354 п.н. Один из |
|||||||||
(межхромомерами). По |
данным, |
мотивов гомологичен сайту посадки |
||||||||
полученным на многих видах двукрылых, |
топоизомеразы II и участку прикрепления |
|||||||||
длина междисков колеблется в пределах |
ядерного скаффолда. |
|
||||||||
0,05-0,38 мкм, чаще всего 0,1-0,2 мкм, или |
4. Анализ частот использования кодонов в |
|||||||||
0,3-3,8 т.п.н. Количество ДНК, |
рамках считывания, найденных в ДНК |
|||||||||
приходящееся на все междиски, составляет |
междиска, а также тех, которые участвуют в |
|||||||||
3-5% от ее общего количества в политенных |
кодировании аминокислот у дрозофилы, |
|||||||||
хромосомах. |
|
|
|
|
показал достоверные различия. Это может |
|||||
|
О генетической функции междисков |
свидетельствовать либо о том, что эти рамки |
||||||||
еще предстоит узнать, т.к. до настоящего |
считывания не кодируют информацию для |
|||||||||
времени в этой области известно мало. Было |
синтеза,либоотом,чтооникодируютбелкис |
|||||||||
показано, что при инсерции транспозонов в |
использованиемредкихкодонов. |
|
||||||||
междиски,жизнеспособностьугомозиготпо |
13.8.3. Ïóôû |
|
||||||||
инсерциям не изменяется. Не было найдено |
|
|||||||||
и какого-то другого мутантного фенотипа. |
|
Вздутиявполитенныххромосомахбыли |
||||||||
|
Недавно была выделена ДНК одного |
описаны одновременно с политенными |
||||||||
èç |
междисков |
è |
|
|
|
|
|
|
|
|
Рисунок 13.10 |
|
|
|
|
||||||
расшифрована ее первичная |
|
|
|
|
||||||
|
1 |
|
|
|
|
|
||||
структура. Использовали |
|
2 |
|
|
|
|
||||
|
|
|
|
|
|
|||||
следующий оригинальный |
|
|
|
|
|
|
||||
|
|
|
3 |
4 5 |
|
|
||||
подход: из ДНК дрозофил, |
|
T |
|
6 |
|
C |
||||
имеющих |
встройку |
|
|
|
|
|||||
|
|
|
|
|
|
|
||||
транспозона в междиск, была |
|
1 |
300ORF2 |
|
600 |
900 |
1289 |
|||
изготовлена |
библиотека |
|
|
|||||||
клонов, проскринировав |
|
|
555 bp |
|
|
ORF1 |
|
|||
которую на |
çîíä |
(ÄÍÊ |
|
|
|
|
|
354 bp |
|
|
транспозона),выделилиДНК, |
Схема распределения мотивов в ДНК междиска 61С7/61С8 у |
|||||||||
имеющую |
фрагменты |
дрозофилы (Из: Жимулев, 1994, стр. 98). 1 - районы прямых и |
||||||||
транспозона и междиска. |
инвертированных повторов, 2. z-ДНК, 3 - районы связывания |
|||||||||
Последний |
фрагмент |
топоизомеразы II, 4 - автономно реплицирующиеся сайты. 5 - |
||||||||
использовали в качестве |
участки прикрепеления скаффолда, 6 - участок встраивания |
|||||||||
инсерции. ORF - открытые рамки считывания. |
|
|||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
324
Политенные хромосомы |
|
|
Глава 13 |
|
|
|
|
|
|
|
|
Рисунок 13.11 |
|
Рисунок 13.12 |
|
|
|
63A1-3 63B9 |
63E2-3 |
à
á
Изображения пуфов 2В, 62Е, 63, 74Е , 75В и |
|
|
|
||
78 в политенных хромосомах дрозофилы (Из: |
|
|
|
|
|
Becker, 1962, в кн. Жимулев 1994). |
|
â |
|
||
хромосомами: Бальбиани в 1881 году нашел |
|
|
|
||
огромные муфтоподобные вздутия в |
|
|
|
||
политенныххромосомахCh.plumosus,которые |
|
|
|
||
в 1910-1912 гг. Эрхард и Альвердез назвали |
|
|
|
||
КольцамиБальбиани. |
|
|
|
||
Одной из выдающихся особенностей |
|
Электронно-микроскопическая фотография |
|||
третьейхромосомыдрозофилПайнтерв1935 |
|
экдизон-индуцируемого пуфа 63E и пуфа |
|||
году назвал серию слабо окрашенных |
|
теплового шока 63B в третьей хромосоме |
|||
|
дрозофилы. Район хромосомы 63A-C до (б) и |
||||
сегментов. Эти сегменты обнаруживают |
|
||||
после (в) теплового шока, до (б) и после (а) |
|||||
поразительноеварьированиедиаметра,хотяу |
|||||
|
индукции экдизоном (неопублико-ванные |
||||
каждойконкретнойличинкиихформаиразмеры |
|
||||
фотографииВ.Ф. Семешина). |
|
||||
довольно константны (см. для примера Рис. |
|
||||
|
|
|
|||
специфического пуфа |
- является |
||||
13.11 è 13.12). |
|
||||
Унекоторыхособейонимогутбытьвтри |
морфологическимпроявлениемактивирования |
||||
разатолще,чемостальнаячастьхромосомы,у |
генаикоррелируетсопределеннымсостоянием |
||||
другихличинокутолщенийвданныхрайонахнет, |
|
дифференцировки. |
|
||
внихобычныедиски.К.Бриджесвтомжегоду |
|
|
Разрыхление материала диска связано с |
||
назвалнекоторыеизвздутий,напримерврайоне |
|
тем, что в области активируемого гена |
|||
2B, пуфами (“вздутиями”). Работая с |
происходит сначала накопление различных |
||||
хромосомамиличиноксциарид,Д.Ф.Полсони |
|
белков, входящих в транскрипционные |
|||
К.В. Метц нашли, что гигантские вздутия, |
комплексы, затем из-за накопления вновь |
||||
характерные для этого вида, формируются из |
синтезируемойРНКибелков,упаковывающих |
||||
дисков,азатемвздутиявновьпревращаютсяв |
эту РНК в специфические гранулы, в составе |
||||
диски. |
|
которых она транспортируется из ядра в |
|||
ДетальныеисследованияВ.Беермана,К. |
цитоплазму. |
|
|||
Павана,М.БройериФ.Мехелькевначале1950- |
В 1961 году В. Беерман нашел |
||||
x годов привели авторов к заключению о том, |
корреляциюмеждупоявлениемособыхгранул |
||||
что пуфы и кольца Бальбиани являются |
секрециивклеткахособойдолислюннойжелезы |
||||
районамихромосом,вкоторыхгенынаходятся |
Ch. pallidivittatus è |
активностью |
|||
в активном состоянии, т.е. разрыхление |
дополнительногоКольцаБальбианивклетках |
||||
материала диска и формирование из него |
|
этой доли. Таким образом впервые была |
|||
325
Глава 13 |
Политенные хромосомы |
|
|
обнаруженасвязьмеждуактивностьюпуфаи продуктом,синтезируемым клеткой.
За последние 10 лет выделена и клонирована ДНК примерно двух десятков пуфов.ЭтаДНК,какоказалось,содержитгены, имеющие оченьбольшуюпротяженность, -50 -120 т.п.н. В составе генов многочисленные экзоны, вступающие в альтернативный сплайсинг, и очень длинные (до 40 т.п.н.) интроны.
Литература к разделу 13.8.
Жимулев И.Ф. Хромомерная организация политенных хромосом. Новосибирск, Наука, 1-564, 1994.
13.9. Гормональный контроль пуфов
У многих видов отряда Diptera, у которых личиночное развитие проходит быстро (за несколько дней), изменения картин пуфов очень динамичны и легко наблюдаются. У наиболее изученного вида - дрозофилы - детально описано пуфирование всех хромосом на протяжении последних 24 часов личиночного развития и 12 часов - предкуколочного. Все пуфы можно
разделить на два типа: крупные, т.е. собственно вздутия, и малые, в которых увеличениядиаметрахромосомынет, однако диски данного района уже разрыхлены, деконденсированы, т.е. транскрипционно активны.
Каждая стадия развития личинки или предкуколки характеризуется определенным набором (паттерном) крупных пуфов. В ходе развитияэтинаборызакономерноизменяются (Рис. 13.13).
Унаиболеемолодыхличинок,укоторых политенные хромосомы уже достаточно крупныеидоступныдляанализа,присутствуют только так называемые межлинечные пуфы (68С на Рис. 13.13). В самом конце личиночногоразвития,примерноза6часовдо формирования предкуколки (пупариума), на фоне резкого повышения титра гормона экдистерона эти пуфы инактивируются и начинаютформироватьсядругиепуфы,сначала “ранние”,т.е.раньшедругих(примерночерез 30 минут) среагировавшие на поступление гормона (74EF и 75В на Рис. 13.13), затем “поздние” - реагирующие с задержкой на несколько часов (78D, 66В, 71СЕ на Рис. 13.13).
Рисунок 13.13
66B
68C
71C-E
74EF
75B
75C-D
78D
6 |
5 |
4 |
3 |
2 |
1 |
0 |
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
8 |
9 |
10 |
11 |
12 |
13 |
|
3-й личиночный возраст |
|
|
|
|
|
Предкуколка |
|
|
|
|
|
Куколка |
||||||
Изменения активности пуфов 3L хромосомы дрозофилы в конце третьего возраста - предкуколочном развитии. По оси абсцисс: стадии развития (в часах). У личинок - время до формирования 0-час предкуколки. (Из: Becker, 1962, в кн. Жимулев, 1994, стр. 209).
326
Политенные хромосомы |
|
|
|
|
|
Глава 13 |
|||
|
|
|
|
|
|
||||
У 0-час предкуколок активность пуфов |
|
|
|
|
|
||||
|
Рисунок 13.14 |
|
|
|
|||||
наивысшая, в том смысле, что в геноме |
|
|
|
|
|
||||
наибольшее число пуфов активны именно на |
|
|
|
|
|
||||
этойстадииразвития.Размерымногихпуфов |
|
|
|
|
|
||||
максимальныименнонаэтойстадииразвития. |
|
|
|
|
|
||||
После достижения пика активности в |
|
|
|
|
|
||||
последующие 2-3 часа происходит быстрый |
|
|
|
|
|
||||
спад активности пуфов, когда в хромосомах |
|
|
|
|
|
||||
присутствуютединичныепуфы.Вконцестадии |
|
|
|
|
|
||||
предкуколкиопятьнафонеповышенноготитра |
|
|
|
|
|
||||
экдистеронапроходитповторнаяволнаранних |
|
|
|
|
|
||||
ипозднихпуфов(Рис.13.13). |
|
|
|
|
|
|
|
||
ИсследованияУ. Клевера и П.Карлсона |
|
|
|
|
|
||||
(U. Clever, P. Karlson), проведенные на |
|
|
|
|
|
||||
хирономусе в 1960 году, и Х.И. Беккера - на |
|
|
|
|
|
||||
дрозофиле в 1962, продемонстрировали, что |
|
|
|
|
|
||||
активность многих пуфов, возникающих в |
|
Майкл Эшбернер |
|
||||||
конце личиночного развития, индуцируется |
|
|
|||||||
|
ðîä. 1942 |
|
|||||||
гормоном экдизоном, контролирующим |
|
|
|||||||
|
|
|
|
|
|||||
метаморфозунасекомых.НесколькопозжеУ. |
циклогексимидом |
- |
добавить |
гормон |
|||||
Клевер в работах на хирономусе показал, что |
экдистерон, ранниепуфы все же образуются, |
||||||||
экдизон вызывает |
целый каскад |
т.е. для их индукции не требуется |
|||||||
взаимосвяанных изменений, в которых гены, |
предварительного синтеза белков. Они |
||||||||
активируемые гормоном раньше, влияют на |
используют те белки, которые были |
||||||||
индукциюгеновболеепозднореагирующихна |
синтезированызадолгодоэтого.Вповедении |
||||||||
гормон. |
|
|
|
|
ранних пуфов обнаружилась еще одна |
||||
Наиболее |
|
фундаментальные |
удивительная особенность. Обычно они |
||||||
исследования процесса активирования генов |
быстрореагируютнагормон-активируются, |
||||||||
(пуфов) под действием гормона провел |
через четыре часа развиваются до |
||||||||
английский генетик М. Эшбернер (M. |
максимальных размеров, затем полностью |
||||||||
Ashburner) (Ðèñ. 13.14). |
|
|
|
инактивируются, |
è |
материал |
ïóôà, |
||
Исследованиягормональнойрегуляции |
компактизуясь, превращается в диск. Под |
||||||||
активности генов удобнее проводить не на |
действием ингибитора синтеза белка ранние |
||||||||
живом организме, а в системе in vitro, т.е. |
пуфы нормально активируются, но их |
||||||||
инкубируяорганывпробирке,благодарячему |
обычной инактивации не происходит (Рис. |
||||||||
можно по усмотрению экспериментатора |
13.15б). Этот факт может свидетельствовать |
||||||||
изменять условия обработки гормонами, т.е. |
только об одном: инактивация ранних пуфов - |
||||||||
варьировать |
èõ |
концентрации, |
такойжегормон-индуцируемыйпроцесс,какиих |
||||||
продолжительность |
|
воздействия, |
индукция. Отсюда вытекает другой важный |
||||||
использовать вещества, прерывающие |
вывод:белки,выключающиеактивностьранних |
||||||||
протеканиеразличныхпроцессов(ингибиторы). |
пуфов,кодируютсявсамихраннихпуфах. |
||||||||
Врезультатесерииостроумныхэкспериментов |
|
Поздние пуфы на фоне ингибирования |
|||||||
М. Эшбернер показал, что ранние и поздние |
синтезабелканеиндуцируются(Рис.13.15а).Это |
||||||||
пуфыразличаютсяпомногимпризнакам. |
|
означает,чтодляихиндукциинеобходимыбелки, |
|||||||
Во-первых, это реакция на ингибиторы |
синтезируемыеподдействиемгормонаэкдизона, |
||||||||
синтеза РНК и белков. Если через час после |
т.е.враннихпуфах. |
|
|
|
|||||
начала инкубации клеток слюнных желез с |
|
Во-вторых,какоказалось,ранниеипоздние |
|||||||
ингибитором |
синтеза |
белков |
- |
пуфы еще более различаются по реакции на |
|||||
327
Глава 13 |
|
|
|
|
Политенные хромосомы |
|||||
Рисунок 13.15 |
|
|
|
Рисунок 13.16 |
|
|
|
|
||
2.2 |
|
|
à |
2.6 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||
1.8 |
|
|
|
2.2 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||
1.4 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
1.8 |
|
|
|
|
|
|
1.0 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
á |
1.4 |
|
|
|
|
|
|
2.6 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
1.0 |
|
|
|
|
|
|
2.2 |
|
|
|
0 |
1 |
|
3 |
|
5 |
|
|
|
|
|
|
|
|||||
1.8 |
|
|
|
Влияние |
удаления |
экдистерона |
èç |
|||
|
|
|
инкубационнойсредынаразмерыраннегопуфа |
|||||||
|
|
|
|
|||||||
1.4 |
|
|
|
74EF (Èç: Ashburner, Richards, 1976, â êí. |
||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||
|
|
|
|
Жимулев, 1994, с. 267). Сплошная линия - |
||||||
1.0 |
|
|
|
изменение размера пуфа в среде с гормоном, |
||||||
0 |
4 |
8 |
12 |
штриховая - при отмывке экдистерона. По осям |
||||||
Развитие позднего пуфа 82F (а) и раннего пуфа |
- êàê íà Ðèñ. 13.15. |
|
|
|
|
|||||
75B (б) под воздействием экдистерона или |
клеткуисвязываниегормонасгенами.Гормон- |
|||||||||
экдистирона с ингибитором синтеза белка |
||||||||||
рецепторный комплекс взаимодействует с |
||||||||||
циклогексимидом(Из:Ashburner,Richards,1976, |
||||||||||
регуляторными |
областями |
генов, |
||||||||
в кн. Жимулев, 1994, с. 264). Черные кружки - |
||||||||||
расположенныхвраннихпуфах,иактивирует |
||||||||||
обработка одним экдистероном. Светлые |
||||||||||
|
|
|
|
|
|
|||||
кружки - Обработка экдистероном вместе с |
их. Для активности ранних пуфов нужно |
|||||||||
циклогексимидом. Ось абсцисс - время |
постоянноеприсутствиегормона.Отмывкаего |
|||||||||
обработки слюнных желез в часах, ось ординат |
приводит к инактивации этих генов. В то же |
|||||||||
- размер пуфов в условных единицах. |
|
время гормон-рецепторный комплекс |
||||||||
удаление гормона из клеток. Если некоторое |
взаимодействует с регуляторными районами |
|||||||||
время инкубировать железы в пробирке в |
генов, расположенных в поздних пуфах, и |
|||||||||
растворе,содержащемгормон,азатемпоместить |
инактивируетих.Попрошествиинекоторого |
|||||||||
вновыйраствор,ноужебезгормона,ранниепуфы |
времени после начала действия гормона |
|||||||||
быстро уменьшаются в размерах и исчезают |
нарабатываются белковыепродукты(Р)генов |
|||||||||
совсем(Рис.13.16).Наиндукциюпозднихпуфов |
из ранних пуфов,которыедействуютдвояко. |
|||||||||
отмывкагормонавлияеточеньспецифично.Если |
Некоторые из этих белков инактивируют |
|||||||||
удалять гормон после 1, 2, 3-х часов от начала |
преждеактивныеранниепуфы(см.Рис.13.18). |
|||||||||
инкубации, то ничего не происходит. Если |
Поэтому |
подавление |
синтеза |
|
белка |
|||||
инкубацияпротекала4иболеечасов,тоудаление |
предотвращает инактивацию ранних пуфов. |
|||||||||
гормонаприводиткбыстройпреждевременной |
Другие белки из этой категории (Р на Рис. |
|||||||||
индукции поздних пуфов (Рис. 13.17). Эти |
13.18)связываютсясрегулирующимизонами |
|||||||||
эксперименты означают, что для поддержания |
поздних генов, вытесняют экдизон- |
|||||||||
активности ранних пуфов гормон нужен |
рецепторный комплекс, в результате чего |
|||||||||
постоянно.Этотжегормонблокируетразвитие |
активируются поздние пуфы. Очевидно, что |
|||||||||
позднихпуфовдоопределенноговремени. |
еслиподавитьсинтезбелка,топоздниепуфы |
|||||||||
Для объяснения результатов своих |
развиваться не будут: в клетках еще не |
|||||||||
опытовМ.Эшбернерпредложилследующую |
синтезированыбелкиР. |
|
|
|
||||||
модель (Рис. 13.18). Гормон (Е) обратимо |
Легкообъяснитьрольотмывкигормона. |
|||||||||
связываетсясмолекулойбелкарецептора(R). |
Поскольку для поддержания активного |
|||||||||
Рецептороблегчаетпроникновениегормонав |
состояния |
ранних |
пуфов необходимо |
|||||||
328
Политенные хромосомы |
|
|
|
|
|
Глава 13 |
|||
Рисунок 13.17 |
|
|
|
уменьшается в результате отмывки. Если в |
|||||
|
|
|
|
|
пробирку, откуда гормон уже удален, вновь |
||||
2.6 |
|
|
|
|
добавить экдизон, поздние пуфы вновь |
||||
|
|
|
|
|
инактивируются(см.Рис.13.17). |
|
|||
|
|
|
|
|
Каквыяснилось,многиепуфыполитенных |
||||
2.2 |
|
|
|
|
хромосом кодируют белки-рецепторы. |
||||
|
|
|
|
|
|||||
|
|
|
|
|
Интересно,чтогенырецептороврасполагаются |
||||
1.8 |
|
|
|
|
каквмежлинечных(42А),такивранних(74EF), |
||||
|
|
|
|
|
|
|
|
||
|
|
|
|
|
поздних (2С) и даже предкуколочных (75CD) |
||||
|
|
|
|
|
(93F)пуфах. |
|
|
|
|
1.4 |
|
|
|
|
Выяснилось |
также, |
что белковые |
||
|
|
|
|
|
молекулы-рецепторывесьмаконсервативны,т.е. |
||||
|
|
|
|
|
независимо от того какой это рецептор и даже |
||||
1.0 |
|
|
|
|
какойизстероидныхгормоновонсвязывает,все |
||||
|
|
|
|
|
|||||
|
4 |
|
8 |
12 |
рецепторыимеютобщийпринципстроения(Рис. |
||||
Преждевременнаяиндукцияпозднегопуфа82F |
13.19).Всемолекулыбелков-рецепторовимеют |
||||||||
врезультатеотмывкиэкдистеронапосле4часов |
4-5доменов,т.е.специфическихучастков.Один |
||||||||
инкубации с гормоном (Из: Ashburner, Richards, |
из доменов (“С” на Рис. 13.19) отвечает за |
||||||||
1976, в кн. Жимулев, 1994, с. 268). Сплошная |
|||||||||
связывание комплекса ER с ДНК, т.е. находит |
|||||||||
линия - инкубация слюнных желез в среде с |
|||||||||
именно тот ген, |
который |
необходимо |
|||||||
гормоном, штриховая - инкубация без гормона. |
|||||||||
активировать. Этот домен содержит 66-68 |
|||||||||
Ïî îñÿì - êàê íà Ðèñ. 13.15. |
|
|
|||||||
|
|
аминокислот. |
|
|
|
||||
постоянное пребывание комплекса ER на |
|
|
|
||||||
регуляторных районах генов, то удаление |
Другойдомен(“Е”наРис.13.19)отвечает |
||||||||
заудержаниегормонавкомплексе.Онсодержит |
|||||||||
гормона приводит к быстрой инактивации |
220 аминокислот. Функции доменов A/B и D |
||||||||
пуфов.Сложнеесреакциейнаотмывкупоздних |
поканеопределены. |
|
|
|
|||||
пуфов. Если начать удалять гормон слишком |
С учетом этих факторов модель |
||||||||
рано, когдабелкиРещенесинтезированы,то |
|||||||||
протекания каскада активирования генов под |
|||||||||
отмывка не вызывает преждевременной |
влияниемгормонаэкдистеронабыладополнена |
||||||||
индукции поздних пуфов. Белки Р |
другиманглийскимгенетикомДж.Ричардсом |
||||||||
синтезируются примерно через3-4часапосле |
(Рис. 13.20). Согласно новому варианту |
||||||||
началадействиягормона.Еслиотмытьэкдизонв |
модели,когдаувеличиваетсятитрэкдистерона, |
||||||||
этовремя,токоличествобелковРвклеткахуже |
его молекулы связываются с двумя |
||||||||
достаточное для того, чтобы вытеснить из |
молекуламибелков-рецепторов:EcRиRO(см. |
||||||||
регуляторных районов генов комплекс ER, |
Рис. 13.20). Этот комплекс поступает на |
||||||||
концентрация которого к тому же быстро |
Рисунок 13.19 |
|
|
|
|||||
Рисунок 13.18 |
|
|
|
|
|
|
|||
|
|
|
|
|
|
Стероидный |
|||
|
|
|
|
|
|
|
|
||
|
E+R |
E-R |
|
|
|
|
|
гормон |
|
|
|
|
|
|
|
|
|||
|
|
|
|
|
A/B |
C |
D |
E |
|
Ранний |
+ |
|
_ |
Поздний |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||||
ïóô |
_ |
|
+ |
ïóô |
|
|
|
|
|
Синтез |
ÄÍÊ |
|
|
||||||
|
|
|
|
|
|||||
|
белка |
|
|
|
|
||||
|
|
|
Обобщенная схема строения молекулы белка- |
||||||
|
|
|
|
|
|||||
|
Ð |
|
|
|
рецепторастероидногогормона(Из:Pongs,1985, |
||||
|
|
|
|
в кн. Жимулев, 1994, с. 301). A/B - домен с |
|||||
Модель индукции ранних и поздних пуфов |
|||||||||
неизвестными функциями, |
С - домен |
||||||||
экдистероном (Из: Ashburner et al., 1974, в кн. |
|||||||||
связывания с ДНК, D - ?, E - домен связывания |
|||||||||
Жимул¸в, 1994, с. 268). |
|
|
|||||||
|
|
со стероидным гормоном - лигандом. |
|||||||
|
|
|
|
|
|||||
329
Глава 13 |
Политенные хромосомы |
|
|
регуляторные участки ранних генов и активирует их. Продуктом раннего гена является другой рецепторный белок - R1, который в гормон-рецепторном комплексе замещает место белка RO, или EcR, или оба этих белка. Образовавшийся в результате этого новый гормон-рецепторный комплекс Ec-EcR-R1 подавляет активность ранних генов и активирует пуфы, возникающие несколько позже ранних. В научной литературе их называют ранними-поздними. Кроме активирования ранних-поздних генов этот вновь образованный комплекс связывается с регулирующими участками поздних генов и инактивирует их. Одним из продуктов активности ранне-поздних пуфов является новый белок-рецептор R2, который образует гормонрецепторный комплекс с гормоном (см. Рис. 13.20), заменяя в старом комплексе EcR или R1 или оба их. Новый комплекс отключает гены, которые произвели сам R2, и одновременно включает поздние гены.
В этой схеме многое еще остается невыясненным, в частности неизвестно, в какихпуфахрасположеныгены,кодирующие рецепторы R1 и R2. Неясно также какую роль играют остальные пуфы. Известно, что в политенных хромосомах функционирует
около 120 крупных пуфов и 220 мелких. Пока выяснена роль только примерно 20 пуфов. Но и эти данные позволили сформулировать модель процесса гормональной регуляции активности генов в клетках эукариот. Это оказалось возможным только потому, что в качестве модели использовали политенные хромосомы, на которых весь процесс можно непосредственно наблюдать под микроскопом.
Таким образом, в результате непосредственного наблюдения политенных хромосом под микроскопом удалось выявить два типа активных районов: междиски и пуфы, возникающие при декомпактизации материала дисков. Районы обоих типов транскрипционно активны. В состоянии дисков гены неактивны. Активирование генов, расположенных в дисках, происходит специфично по отношению к стадии развития или определенной ткани. Материал декомпактизуется, и ген начинает работать. Междиски находятся в постоянно декомпактизованном состоянии. Повидимому они постоянно, т.е. в большинстве тканей и на всех стадиях развития, активны.
Рисунок 13.20 |
|
|
|
|
|
Ранние гены |
Ранне-поздние гены |
- Поздние гены |
|||
+ |
- |
|
+ |
-(?) |
+ |
Ec |
|
|
Ec |
|
Ec |
EcR R0 |
|
R1 |
EcR R1 |
R2 |
EcR R2 |
|
|
Ec |
|
Ec |
|
Ec + EcR + R0 |
EcR R1 |
|
EcR R2 |
|
|
Увеличение титра экдистерона |
|
|
|
||
0 |
|
|
|
3 |
6 |
|
|
|
|
|
Время, ч |
Модель активирования каскада генов в клетках слюнных желез дрозофилы с помощью гормона |
|||||
экдистерона (Из: Richards, 1992, в кн. Жимулев, 1994, с. 305 ). Ec - экдистерон, EcR - продукт |
|||||
гена EcR (белок-рецептор из пуфа 42А). RO - рецептор из этой же группы, что и EcR. R1 и R2 |
|||||
- продукты соответственно ранних и ранних-поздних пуфов. |
|
||||
330 |
|
|
|
|
|