Подготовка у универсиаде 2012 / Генетика (Жимулев) / 14ver7

Мишенью, улавливающей сигнал от соотношения X:A, является самцовоспецифическое включение гена xol-1 (X0 lethal), который контролирует как детерминацию пола, так и дозовую компенсацию. У самцов уменьшение дозы X-хромосом приводит к более высокому уровню транскрипции, а у гермафродитов увеличение дозы – к более низкому уровню. Нулевые аллели xol-1 не влияют на формирование нормальной морфологии XX гермафродитов, но они обуславливают феминизацию и гибель X0 особей.

На рис. 14.11. представлена схема взаимодействийгенов,индуцируемыхгеном xol-1, и приводящих к формированию фенотипа и гермафродитов.

Литература к разделу 14.6.

Смирнов А.Ф. Молекулярно-генетические механизмы первичной детерминации пола у млекопитающих. Соросовский образовательный журнал 1: 26-34, 1997.

Meyer B.J. Sex determination and X chromosome dosage compensation. In: C. elegans (vol. 2) (D.L. Riddle, Blumenthal T., B.J. Meyer and J.R. Priess, eds.), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 209-240, 1997.

Cline T.W., Meyer B.J. Vive la difference: males vs females in flies vs worms. Annual Rev. Genet. 30: 637-702, 1996.

14.7. Компенсация дозы генов

Как уже было отмечено выше, в генетическом смысле оба пола как у дрозофилы или нематоды, так и у млекопитающих различаются только числом и составом половых хромосом. При этом у самцов гены, локализованные в X- хромосоме, представлены в одной дозе, а у самок - в двух. Если бы X-хромосомныегены функционировали с одинаковой интенсивностью, количество продуктов этих генов у самок было бы вдвое большим, чем у самцов. Однако, этого не происходит. Существуют механизмы компенсации дозы генов. Разумно a priori предположить, что для уравновешивания интенсивности

функционирования X-хромосомных генов можно заставить их функционировать вдвое интенсивнееусамцов,илижеинактивировать одну из X-хромосом у самок. Природа использовала оба механизма. У дрозофилы дополнительноактивируетсяединственнаяXхромосома самца до уровня двух X- хромосом самки, а у млекопитающих инактивируется одна X-хромосома, в результате чего уровень экспрессии у самок уменьшается до уровня единственной X- хромосомы самца.

14.7.1. Компенсация дозы генов у дрозофилы

Основные открытия в области дозовой компенсации у дрозофилы были сделаны в результате анализа политенных хромосом слюнных желез личинок. У самцов (XY) единственнаяполитеннаяX-хромосомадолжна бы быть наполовину тоньше, чем две спаренные аутосомы или две спаренные X- хромосомы у самки. Однако, на цитологическихпрепаратахонатоньшетолько на 25% и выглядит значительно более разрыхленной,чемостальныехромосомыиXхромосомы у самки (Рис. 14.9). Вообще известно, что разрыхленность структуры хромосом связана с более активной транскрипцией в них. Компактный материал транскрипционно неактивен, декомпактизованныйразрыхленныйматериал

Рисунок 14.13

Локализация белка MLE (красная флуоресценция) в политенной X-хромосоме самца. Аутосомы окрашены синей флуоресцирующей краской и не содержат белка MLE (Рисунок любезно предоставлен M. Kuroda и П. Гордадзе).

обнаруживает высокую активность в синтезе РНК.

Ужепервыеэкспериментыпоказали,что

âединственной политенной X-хромосоме самца количество негистоновых белков примерно в 1,5 раза больше, чем было бы в одной X-хромосоме самки. Разрыхленность структуры и обогащенность негистоновыми белками является структурной основой для дозовой компенсации. Действительно, интенсивность транскрипции в одной политенной X-хромосоме самца в два раза выше, чем в одной X-хромосоме самки.

Оказалось, что существует механизм, контролирующийформированиеразрыхленной структурыединственнойХ-хромосомысамца. Выделеныпродукты пяти генов: msl-1, msl-2, msl-3 и mle (MSL-белки) и mof, а также по крайней мере 2 вида РНК, участвующих в этом процессе. Все пять белков образуют комплекс и связываются с сотнями участков Х-хромосомы самца, обеспечивая диффузность ее структуры. Присутствие в комплексе каждого из MSL белков необходимо для нормального функционирования всего комплекса. Комплексдозовойкомпенсациилокализуется только в X-хромосомах самцов (Рис. 14.9).

Рассмотрим кратко характеристики белков, входящих в этот комплекс.

Âбелке MSL-2 был обнаружен особый участок, имеющий способность интенсивно связываться с ДНК и называемый рингфингером, MSL-3 белок имеет другой активный участок - “хромо-домен” - особенность, характерную для белков, связывающихся с хроматином. Кроме MSL белков в этом процессе участвуют молекулы другихбелков-гистоновH4.Гистоныобычно выполняютобратнуюфункцию-вкомплексе смолекулойДНКониобразуютнуклеосомы,

âсоставе которых ДНК упаковывается более плотно и становится более компактной. Гистоны H4, декомпактизующие Х- хромосому, отличаются от гистонов H4, компактизующих ДНК тем, что они модифицированы: аминокислота лизин, находящаяся в 16 положении в молекуле H4, унихацетилирована,т.е.содержитацетильный

остаток. Оказалось, что такие модифицированные, или H4Ac16, гистоны в хромосомах локализуются в тех же самых районах, что и MSL белки. Модификацию гистоновH4,по-видимому,производятбелки MOF, входящие в комплекс. Как выяснилось генmof кодируетферментацетил-трансферазу.

Предполагают, что белки MSL взаимодействуют с регуляторными элементами хромосом, контролирующими транскрипцию и структуру хроматина. Молекулярный анализ гена mle показал, что он имеет гомологию с известными ранее генами, участвующими в расплетании двух цепей ДНК - процесса, необходимого для транскрипции(ферментгеликаза).БелокMLE имеет АТФ-связывающийся домен. Поэтому белок часто называют РНК-геликазой.

Белки MSL обладают другой особенностью.Недавноудалосьпоказать,что антитела, выработанные на белки MSL у

Drosophila melanogaster, связываются также с Х-хромосомами самцов других видов двукрылыхнасекомых.Этосвидетельствуето том, что все белки, участвующие в дозовой компенсации, высоко консервативны, а сам механизм дозовой компенсации возник в эволюцииоченьдавно.

В 1997 году было установлено существование нового класса РНК, некодирующих белки и имеющих замечательное свойство связываться с политенными X-хромосомами только у самцов. Эти РНК, называемые roX (RNA on X-chromosome). К настоящему времени выделены 2 гена roX, roX-1 и roX-2. Они имеют следующие свойства:

1.С обоих генов считываются транскрипты, специфичные только для самцов.

2.Существование и распределение РНК в X-хромосоме зависит от наличия полного белкового дозово-компенсирующего комплекса. У мутантных личинок, у которых отсутствует один из белков MSL, X- хромосомасамцанепокрытаРНК-белковым комплексом полностью , выявляется только от 20 до 40 сайтов (Рис. 14.10). Эти сайты

былиназваны«входными» (entry) участками в хроматин. Два из них соответствуют участкам локализации генов roX-1 и roX-2 (в районах 3Fи 10C). Полагают, что вокруг синтезирующейся РНК генов roX и образуется РНК-белковый дозовокомпенсирующийся комплекс. Такой комплексобразуетсяивучасткевстраивания гена roX в аутосому (см. Рис. 14.10).

интрона. В гене msl-2 есть ещ¸ один сайт связываниясбелкомSXL-на3’-конце(3’UTR на Рис. 14.13). Непонятно каким образом вс¸ это влияет на трансляцию гена msl-2 у самки, тем не менее продукт гена msl-2 не поступает в ядро. В его отсутствие, другие белки msl не способны ассоциировать с Х-хромосомами, ацетилированныеформыгистоновH4Ac16не накапливаются, и Х-хромосома самки не

нуклеотидов в генах roX-1 и ro-X-2 показал, что они разные . Однако, в X-хромосомах локализуются в одних и тех же местах. Повидимому, в комплекс входят многочисленные РНК из семейства roX.

4. В участках встраивания гена roX в аутосому очень часто происходит экспансия образования roX-белковых комплексов на соседние, в том числе и весьма удаленные районы. Так, если на Рис. 14.10 виден небольшой меченый участок в сайте встраивания гена roX, то на Рис. 14.11 этот участок становится очень большим, что свидетельствует о распространении комплекса вдоль по хромосоме.

Дозовая компенсация у дрозофилы контролируется тем же геном Sxl, который осуществляетиобщийконтрользаразвитием пола. Нормальный белок гена Sxl предотвращаетдозовуюкомпенсациюусамок, непозволяябелкамMSLрасположитьсянаих Х-хромосомах. В случае мутации гена Sxl, белкиMSLпоявляютсявХ-хромосомахсамок (Рис. 14.12В), нарушая тем самым весь процессдозовойкомпенсации.

Полагают, что белок гена Sxl взаимодействует в первую очередь с геном msl-2 (Рис. 14.12):

У самок, у которых отношение числа Х- хромосомкчислуаутосомсоставляетединицу, генSxl находитсяво“включенном”состоянии (см. выше) и он подавляет трансляцию мРНК гена msl-2. Небольшой интрон в 5’- нетранслируемомрайоне(UTRнаРис.14.13) удаляетсявтранскриптегенаmsl-2 усамца,но сохраняется в транскрипте самки. Таким образом белок гена Sxl непосредственно контролируетальтернативныйсплайсингэтого

Ðèñ. 14.13).

У самцов, где отношение Х-хромосом и аутосомсоставляет0.5,ген Sxl выключен(см. выше). В отсутствие белка Sxl ген msl-2

Рисунок 14.10

Локализация белков дозово-компенсирующего комплекса у мутантов msl3, имеющих трансгенный ген roX-2 в аутосоме. В X- хромосоме выявляются только 20-40 районов (entry sites), в аутосоме присутствует один участок, соответствующий сайту встраивания гена roX-2 (указан стрелкой) (Рисунок любезно предоставлен M. Kuroda и П. Гордадзе).

Рисунок 14.11

Распространение локализации roX-белкового комплекса в участке встраивания roX-гена в аутосому (скобка). Справа расположена X- хромосома самца (Рисунок любезно предоставлен M. Kuroda и П. Гордадзе).

самки, РНК гена Xist не находят у самцов и особей X0, имеющих только одну (активную)X-хромосому.ВнутриклеткиРНК Xist не находят ни в цитоплазме в целом, ни в рибосомах. Это свидетельствует о том, что данный ген не кодирует белок и его РНК не транслируется. Вместе с тем, РНК гена Xist легко выявляется в клеточном ядре, а именно втельцеБарра.Большинствоисследователей предполагает, что эта РНК участвует непосредственновпроцессахинактивации X- хромосомы.

Ген Xist у человека занимает около 45 т.п.н. геномной ДНК, однако суммарная длина его восьми экзонов составляет только 16.5 т.п.н. (Рис. 14.17).

Показано наличие альтернативного сплайсинга при экспрессии гена Xist. Множество выделенных кДНК клонов не содержали экзонов N4 или 6i, реже встречались клоны с отсутствием других экзонов. Данные Нозерн-блот анализа позволили обнаружить еще один любопытный факт: сигнал гибридизации выявлялся не в виде дискретных полос, а был представлен непрерывным мазком, указывающим на наличие многочисленных транскриптов гена Xist, которые значительно варьируют по размерам, достигая 10 т.п.н. и выше. Результаты PCR-анализа, предпринятого с целью нахождения стартовой точки транскрипции, выявили несколько транскриптов различной длины, что свидетельствует о гетерогенности в инициации транскрипции гена Xist и, следовательно, о наличии нескольких сайтов инициации. Кроме того, отсутствовалТАТАдомен поблизости от этого стартового сайта, хотяблокСААТбылрасположенвположении -99. ТАТА-домен был обнаружен в позиции -

39 относительно минорного стартового сайта.

Ген Xist был найден у многих млекопитающих. У всех видов в экзонах нет длинных рамок считывания, самая длинная - 483 п.н., т.е. примерно 3% от общей длины экзонов.

Распространение сигнала от гена XIST на другие участки X-хромосомы не требует наличияпоследовательностей,специфичных для этой хромосомы. Но инактивирующий сигнал распространяется более эффективно именно в X-хромосоме. Для объяснения этого факта была предложена гипотеза о наличии в X-хромосоме участков усиления и передачи сигналов (“way stations” или “boosters”). Природа этих участков усиления неизвестна, хотя накапливаются сведения о том, что это могут быть умеренные повторы. Элементы LINE (см. Раздел 6.7.4.) не обнаруживают обычного следования распределениюматериалаприG-окраске,но “окрашивают” X-хромосому у мыши и человека униформно и очень ярко. Поэтому полагают, что LINE-элементы могут рассматриваться в качестве кандидатов на роль усилителей сигнала от гена XIST.

Согласно современным представлениям (Рис. 14.18) РНК Xist (зеленые и красные кружки на Рис. 14.18) взаимодействуют локально с хроматином (желтые квадраты той X-хромосомы, с которой инициируется транскрипция Xist). В результатеэтоприводитккомпактизацииэтой хромосомы (зигзаг на Рис. 14.18) и связыванию ее с ядерной оболочкой в результате чего из одной X-хромосомы у самки млекопитающих формируется компактное образование, называемое половым хроматином или тельцем Барра,