4. Ограничения просвечивающей микроскопии при исследовании живой ткани.
Трансмиссионная (просвечиваюшая) микроскопия реализуется с помощью трансмиссионных электронных микроскопов (ТЭМ), в которых тонкопленочный объект просвечивается пучком ускоренных электронов с энергией 50-200 кэВ. Электроны, отклоненные атомами объекта на малые углы и прошедшие сквозь него с небольшими энергетич. потерями, попадают в систему магнитных линз, которые формируют на люминесцентном экране светлопольное изображение внутр. структуры. При этом удается достичь разрешения порядка 0,1 нм, что соответствует увеличениям до 1,5 х 106 раз. Рассеянные электроны задерживаются диафрагмами, от диаметра к-рых в значительной степени зависит контраст изображения. При изучении сильнорассеивающих объектов более информативны темнопольные изображения.
Разрешение и информативность ТЭМ-изображений во многом определяются характеристиками объекта и способом его подготовки. При исследовании тонких пленок и срезов полимерных материалов и биол. тканей контраст возрастает пропорционально их толщине, но одновременно снижается разрешение. Поэтому применяют очень тонкие (не более 0,01 мкм) пленки и срезы, повышая их контраст обработкой соединений тяжелых металлов (Os, U, Pb и др.), вследствие чего происходит хим. контрастирование.
Схема устройства трансмиссионного электронного микроскопа: 1 - электронная пушка; 2 - конденсор; 3 -образец; 4, 5- объектив и его диафрагма; 6, 7- промежуточная и проекционная линзы; 8 -смотровое окно; 9 - люминесцентный экран; 10 - фотокамера с затвором; 11 - вакуумная система. Структура гелей, суспензий, эмульсий и биол. тканей с большим содержанием воды м. б. исследована методами криорепликации. Просвечивающий электронный микроскоп имеет несколько принципиальных особенностей: поскольку электронный поток сильно поглощается веществом, то внутри установки должен быть создан вакуум; по этой же причине исследуемый образец должен быть очень тонким (порядка 100 нм), и его изготовление является сложной задачей.
Сложности электронной микроскопии состоят в том, что:
для исследования биологических образцов необходима специальная обработка препаратов;
электроны обладают очень ограниченной проникающей способностью, поэтому следует изготавливать ультратонкие срезы, толщиной 50 – 100 нм. Для того, чтобы получить столь тонкие срезы, ткани сперва пропитывают смолой: смола полимеризуется и формирует твердый пластмассовый блок. Затем с помощью острого стеклянного или алмазного ножа срезы нарезают на специальном микротоме;
при прохождении через биологическую ткань электронов не получается контрастного изображения. Для того, чтобы получить контраст, тонкие срезы биологических образцов пропитывают солями тяжелых металлов.
5. В чем заключается погрешность микрозондового исследования, обусловленная процессами флуоресценции. Микрозонд — прибор для проведения рентгеноспектрального микроанализа (определения атомного состава вещества в малом объёме).
Принцип действия микрозонда следующий: генерируется пучок электронов, который собирается электромагнитными линзами в узкий пучок — электронный зонд. Попадая в образец электроны выбивают электроны с оболочек атомов вещества, и генерируют характеристическое рентгеновское излучение. В настоящее время микрозонд обычно является вариантом растрового электронного микроскопа, оптимизированного для рентгеноспектрального анализа. Рентгенофлуоресцентный анализ (РФА) — один из современных спектроскопических методов исследования вещества с целью получения его элементного состава, то есть его элементного анализа. Метод РФА основан на сборе и последующем анализе спектра, полученного путём воздействия на исследуемый материал рентгеновским излучением.
Пучок электронов падает на поверхность образца и, взаимодействуя с его атомами, генерирует характеристическое рентг.изл. Рен. лучи отражаются на линзу и на соседние атомы. Они также отражает рен. изл. на линзу. Получается, мы делаем ошибочный анализ, когда складываем излучения и изучаемых атомов, и других атомов. Чтобы этого не происходило, энергия «наших» атомов должна быть больше, чем у других.
