med_genetika

При организации массового скрининга новорожденных необходимо строго соблюдать определенные требования, каждое из которых имеет важнейшее значение в процессе его проведения. При этом необходимо руководствоваться международными требованиями Всемирной Организации Здравоохранения

(ВОЗ):

∙обследование проводится на заболевание ребенка, которое развивается постепенно и в манифестной фазе делает его инвалидом. При этом имеются проверенные методы предупреждения формирования патологического фенотипа;

∙тип наследования болезни и ее патогенез должны быть четко установлены, а для семьи доступна медико-генетическая консультация;

∙методы скрининга, подтверждения диагноза и превентивного лечения должны быть доступны для практического здравоохранения;

∙ложно-положительные результаты методов скрининга должны быть редкими, а ложно-отрицательные – исключены;

∙стоимость программ массового скрининга не должна превышать расходов на содержание и лечение детей, ставших инвалидами из-за данного заболевания (коэффициент «стоимость-эффективность» программ не должен превышать 1);

∙права семьи и самого ребенка, у которого по данным скрининга обнаружено наследственное (врожденное) заболевание, должны быть защищены (полная информация родителей о скрининг программе, право на отказ от включения их ребенка в число

обследуемых, конфиденциальность при подтверждении диагноза, сохранение врачебной тайны).

Селективный скрининг. В отличие от программ массового скрининга селективный скрининг предусматривает обследование определенных детских коллективов с отклонениями в состоянии здоровья для выявления наследственной патологии. Чаще всего для этих целей используются качественные или полуколичественные методы, в качестве материала для исследования - моча или кровь. Цель селективного скрининга – выявить необычные метаболиты или избыток их накопления и/или выделения (биологическая жидкость) для диагностики наследственного заболевания обмена веществ. В различных лабораториях могут использоваться разные методы идентификации метаболита в зависимости от возможностей, квалификации специалиста и выбора предпочтительных методов исследования. В то же время не имеет значения, каким методом проведена идентификация метаболита, если результат точен и получен в кратчайшие сроки.

Расширение возможностей лабораторной диагностики наследственных болезней, особенно моногенных, с помощью методов молекулярногенетической диагностики не дает никаких оснований каждому врачу, имеющему дело с ребенком с подозрением на наследственное заболевание

101

обмена веществ, отказаться от проведения скрининговых исследований как исследований первого порядка, наряду с точным описанием клинического фенотипа. При этом чрезвычайно важно учитывать последовательность выполнения диагностических исследований, начиная от скрининга (цветных тестов) до окончательной идентификации исследуемого метаболита.

Конечным этапом проведенных исследований является точная верификация нозологической формы заболевания и степень тяжести выявленных метаболических расстройств, что достигается путем последовательного проведения всего комплекса диагностических мероприятий, в том числе использования методов подтверждающей диагностики.

Подтверждающаяся (верифицирующая) биохимическая диагностика.

С помощью этих методов подтверждается или отвергается диагноз у лиц с клиническими симптомами болезней или у лиц с подозрением на наследственные болезни, выявленные при массовом или селективном скрининге. Для диагностики могут использоваться различные биологические материалы (кровь, сыворотка крови, плазма, моча, пот, спинномозговая жидкость), культура клеток (фибробласты, лимфоциты, гепатоциты). Для верификации наследственной патологии применяются соответствующие методы и лабораторная аппаратура.

Разработки новых технологий исследования ДНК и РНК, аналитической биохимии, иммунологии, энзимологии, на основе которых были разработаны новые или более совершенные методы диагностики наследственных болезней, расширили диагностические возможности клинической генетики и медикогенетической практики. Были созданы целые программы диагностики наиболее распространенных моногенных наследственных заболеваний, определены показания для целенаправленного обследования больного.

Таким образом, на сегодня разрешающая способность методов пренатальной диагностики очень высока: при УЗИ – 90%, при кариотипировании плода и ДНК-диагностики достигает 100%.

5. Перспективы генетики

Генетика человека уже сегодня вносит огромный вклад в практику медицины. Однако это лишь малая часть ожидаемого. Перспектива применения достижений генетики в медицине превосходит самые смелые прогнозы оптимистов. Рассмотрим лишь те из них, которые уже начали давать ощутимые результаты.

5.1 ДНК-диагностика. Позволяет с абсолютной достоверностью выявлять генные мутации, определять их тип и локализацию. Цели ДНК-диагностики: подтверждение клинического диагноза, пресимптоматическая диагностика, пренатальная диагностика, диагностика гетерозиготного носительства, геномная дактилоскопия, диагностика инфекций. Области применения ДНКдиагностики: моногенные болезни, мультифакториальные заболевания (определение “ главных” генов, гаплотипы, HLA-ассоциации и т.д.), онкологические заболевания, инфекционные болезни, судебная медицина,

102

(идентификация личности, определение степени родства), санитария и гигиена, трансплантология, иммунология, патологическая физиология и др.

Этапы проведения ДНК-диагностики включают картирование гена (определение положения гена в хромосоме), секвенирование (клонирование) – расшифровка нуклеотидной последовательности ДНК гена и, наконец, изучение спектра мутаций гена.

Существуют два методических подхода диагностики ДНК: прямые методы

– идентификация мутантного гена и косвенные – выявление мутантной хромосомы, сцепленных маркеров.

Алгоритм проведения ДНК-диагностики.

1.Получение ДНК из образцов ( физические и химические методы)

2.Рестрикция (разрезание молекулы ДНК) и получение небольших фрагментов при помощи полимеразной цепной реакции или рестриктаз (эндонуклеаз).

3.Электрофорез фрагментов ДНК в геле на фракции в зависимости от молекулярной массы.

4.Гибридизация с маркерными зондами для визуализации и идентификации искомых фрагментов ДНК.

Внастоящее время существует возможность диагностировать практически все возможные мутации ДНК. В России разработаны маркеры для 50 наиболее распространенных наследственных заболеваний человека.

Широкое применение в ДНК-диагностике получил метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) вследствие своей простоты и экономичности.

Внастоящее время ПЦР представляет процесс, протекающий в одной пробирке и состоящий из повторных циклов амплификации (размножения, копирования) специфической последовательности молекулы ДНК с целью получения достаточно большого количества копий, которые могут быть выявлены обычными методами детекции.

ПЦР протекает в программируемом термостате (амплификатор, термоциклер) в присутствии свободных нуклеотидов, ДНК-полимеразы и специфических зондов (праймеров), которые маркируют определенный участок ДНК, взятой для исследования.

Полимеразная цепная реакция позволяет в течение нескольких часов

выделить и размножить определенную последовательность ДНК в количестве, превышающем исходную в 108 раз. При амплификации с помощью ПЦР используют два олигонуклеотидных праймера (затравки), фланкирующих участок ДНК, специфичный для определяемого возбудителя. Амплификация заключается в повторяющихся циклах, представляющих собой трехступенчатый процесс, протекающий при различных температурах: I - денатурация ДНК при 95° С 1 мин.; II - отжиг праймеров с комплементарными последовательностями (40-60° С, 1-2 мин.); III - последующая достройка полинуклеотидных цепей от праймеров с помощью ДНК-полимеразы при температуре 70-75° С 1-2 мин. Праймеры ориентированы таким образом, что синтез с помощью ДНК-полимеразы протекает только между ними, удваивая

103

количество копий этого участка ДНК. Амплифицированный участок именуют «ампликоном». В результате происходит экспоненциальное увеличение количества специфического фрагмента приблизительно в 2п раз, где n - число прошедших циклов амплификации. Продолжительность одного цикла - 3-5 минут. Таким образом, за 2 часа можно получить около миллиарда копий, определяемой последовательности ДНК. В качестве праймеров используют специально синтезированные специфические дезоксиолигонуклеотиды длиной 20-30 оснований, комплементарные участку ДНК данного возбудителя или гена (рис. 17). Обычно используют 30-50 циклов ПЦР для того, чтобы образовать достаточное для регистрации количество копий участка ДНК.

104

Рис. 17. Принцип ПЦР.

105

В большинстве случаев в качестве метода детекции используется электрофорез, с помощью которого производится разделение амплифицированного материала по размеру ампликонов. Наиболее точным и перспективным является применение метода капиллярного электрофореза в сочетании с лазерной количественной регистрацией продуктов ПЦР.

5.2Генотерапия – способ лечения наследственных, мультифакториальных

иненаследственных болезней путем введения генов в клетки

пациентов с целью направленного изменения генных дефектов или придания клеткам новых функций. В настоящее время проводится введение генов только в соматические клетки, т.к. не передается по наследству и носит исключительно заместительный характер.

Существуют два основных методических подхода при использовании генотерапии: введение генетического материала непосредственно в организм и перенос генетической конструкции в культуру клеток, взятых у больного с дальнейшей реинфузией.

Методы генетической трансфекции (доставки):

1.Химические (Ca-фосфат преципитация).

2.Физические (электропорация, микроинъекция, бомбардировка частицами, простая инъекция).

3.Липосомы (рецептор-опосредованный эндоцитоз, ДНК-белковый комплекс, ДНК-вирусная капсида).

4.Рекомбинантные векторные вирусы (аденовирусы, ретровирусы). Последний метод наиболее эффективен, т.к. сочетает высокую тропность к

клеткам-мишеням, безопасность (предварительно у вируса извлекают участок генома, отвечающий за репликацию) и хорошую экспрессию.

Стандартная схема генокоррекции (протокол) включает следующие пункты:

∙клиническое обоснование генотерапии;

∙схема конструирования ДНК;

∙процедура доставки ДНК больному;

∙тип клеток-мишеней;

∙биологическая безопасность генной конструкции;

∙способ оценки эффективности действия вводимого гена;

∙оценка клинического эффекта;

∙возможность побочных эффектов и пути их предупреждения.

Втаблице 4 приведен список болезней, для которых уже имеются официально утвержденные протоколы и проведены клинические испытания.

106

Таблица 4

Генотерапия некоторых наследственных заболеваний

* В случае, если «лечебный» ген вводится непосредственно в ткани пациента, в скобках указан способ его доставки. В остальных случаях введение гена производили в клетки, извлеченные из организма больного и культивируемые в пробирке.

5.3 Международный проект «Геном человека». Один из наиболее фантастичных, дорогостоящих и потенциально важных проектов в истории науки.

Цель проекта заключается в выяснении последовательности оснований во всех молекулах ДНК клеток человека. Одновременно должна быть установлена локализация всех генов, что помогло бы выяснить причины наследственных заболеваний и открыть пути к их лечению.

В выполнении проекта задействовано несколько тысяч ученых, специализирующихся в биологии, химии, математике, физике и технике. Это один из самых дорогостоящих научных проектов в истории цивилизации. В 1990 году на изучение геномов было потрачено 60 млн долларов, в 1991 году — 135 млн, в 1992-1995 годах ежегодно выделялось от 165 до 187 млн долларов, а в 1996-1998 годах только США расходовали 200, 225 и 253 млн долларов ежегодно.

Чтобы последовательно приближаться к решению проблемы картирования генов человека, было сформулировано пять основных задач:

1)завершить составление детальной генетической карты, на которой были бы помечены гены, отстоящие друг от друга на расстоянии, не превышающем в среднем 2 млн оснований (1 млн. оснований принято называть 1 мегабаза, сокращенно Мб, от англ. слова «base” - основание);

2)составить физические карты каждой хромосомы (разрешение 0,1 Мб);

107

3)получить карту всего генома в виде охарактеризованных по отдельности клонов (5 тыс. оснований в клоне, или 5 килобаз, Кб);

4)завершить к 2004 году полное секвенирование ДНК (разрешение 1 основание);

5)нанести на полностью завершенную секвенсовую карту все гены человека (к 2005 году).

Ожидалось, что, когда все указанные цели будут достигнуты, исследователи определят все функции генов и разработают методы биологического и медицинского применения полученных данных.

До 2000 года были установлены последовательности 30 181 генов человека. Тем самым получена информация примерно для половины генов человека. Когда будет установлена локализация всех генов человека, а также всех мутантных генов, отвечающих за наследственные болезни, можно будет говорить о молекулярной медицине, анатомии и патологической анатомии генома человека. На рисунке 18 демонстрируется патологическая анатомия первой хромосомы человека.

Рис. 18. Патологическая анатомия 1 хромосомы

108

Впечатляющие успехи геномных исследований, осуществляемых международной и рядом национальных программ "Геном человека", становятся достоянием не только сообщества ученых-биологов, но и всего общества, обсуждающего проблемы блага и зла при использовании огромного объема получаемой генетической информации. Так сформировалась "этическая компонента" программы "Геном человека", которая включает следующее: каждый член общества и общество в целом должны ясно представлять значение картирования и секвенирования генома человека; постоянно контролировать социальные, этические и правовые аспекты геномных исследований; поощрять общественные дискуссии по данным вопросам, отрабатывая тактику в выборе приемов, гарантирующих, что генетическая информация будет использована только во благо отдельному лицу, членам его семьи, обществу. Рабочая группа проекта "Геном человека" США перечислила некоторые, наиболее важные сегодня области особого внимания в "этической компоненте" геномных исследований: использование генетической информации в отношении страхования и трудоустройства (предупреждение дискриминации носителей тех или иных "особых" генов); в вопросах уголовного правосудия, усыновления, годности к военной службе; получения желаемого образования (специальности); достижения конфиденциальности генетической информации; совершенствование программ здравоохранения по дородовой и пресимптоматической диагностике наследственных болезней, скрининга на выявление носителей "больных" генов при отсутствии методов лечения болезней, вызываемых этими генами; генетическое образование медицинского персонала, пациентов и населения в целом; история развития генетики, евгеническое движение, генетика поведения.

5.4 Экстракорпоральное оплодотворение (ЭКО) – метод преодоления бесплодия, основанный на предварительном оплодотворении женской яйцеклетки в лабораторных условиях, доведении ее до определенной стадии развития и последующем внесении эмбриона в полость матки. Дальнейшее развитие плода продолжается в матке женщины и заканчивается обычными родами.

Основанием для разработки метода послужили случаи трубного бесплодия, связанные с необратимой окклюзией маточных труб у женщин при полностью сохранившейся способности к образованию яйцеклеток. По данным статистики, такая форма бесплодия отмечается у 9-18 % лиц, обращающихся за помощью. Эффективность метода пока низкая: положительные результаты достигаются примерно в 5% случаев. Постепенное овладение техникой и совершенствование метода позволяют предвидеть определенный прогресс в его практическом применении.

В 1978 году в Англии родилась Эльза Браун – первый ребенок, зачатый в пробирке в результате ЭКО и в виде эмбриона перенесенный в матку матери на ранних этапах дробления. К настоящему времени с помощью методов вспомогательных репродуктивных технологий, обеспечивающих

109

оплодотворение яйцеклетки вне организма в случаях невозможности зачатия естественным путем, рождены многие тысячи детей. ЭКО непрерывно совершенствуется, и все большее число людей с его помощью решает проблему деторождения. Разработаны методы криоконсервации эмбрионов и половых клеток, срок хранения которых - от 5 до 10 лет.

Метод ЭКО и ПЭ (перенос эмбрионов) в полость матки впервые в нашей стране был разработан в Москве в Научном центре акушерства, гинекологии и перинатологии Российской Академии медицинских наук. В феврале 1986 года в России родился ребёнок у абсолютно бесплодной женщины, зачатый с помощью ЭКО и ПЭ. Сейчас в России работают около 20 центров ЭКО.

Каждый год в мире до 700 000 супружеских пар лечатся по программе, которая получила название «Вспомогательной репродукции». С помощью этих методов каждый год рождается более 30 тысяч детей. В Голландии, Дании, Израиле до 1% детей рождаются в результате применения ЭКО.

В1993 году по расчетам специалистов, около 3 миллионов женщин детородного возраста страдали абсолютным бесплодием. С ухудшением экологии снижается возможность нормального зачатия.

Различают условно четыре вида бесплодия: мужское, если женщина здорова, а у мужчины оплодотворяющая способность спермы снижена. Женское – значит, причина бесплодности брака в нарушении репродуктивной способности женщины. Смешанное - когда нарушения есть и у мужчины, и у женщины. Необъяснимое - когда и женщина, и мужчина здоровы, а беременность не наступает.

Впроцентном соотношении на долю мужского, женского и смешанного бесплодия приходиться по 30 % , а на необъяснимое - 10 %. В последние годы мужское бесплодие увеличивается.

Единственным показанием к ЭКО является абсолютное бесплодие. Раньше супружеская пара считалась бесплодной, если беременность не наступала в течение 3-4 лет. В настоящее время этот срок уменьшился до одного года регулярной половой жизни.

ПОКАЗАНИЯ (выдержка из приказа по ЭКО № 303)

∙плохое качество спермы (олигоастеноазооспермия 1-2 степени)

∙абсолютное трубное бесплодие (отсутствие маточных труб или не устраняемая хирургическими методами их непроходимость);

∙бесплодие, обусловленное эндометриозом (при безуспешности медикаментозной и др. методов консервативной терапии);

∙эндокринное бесплодие (при безуспешности гормонотерапии);

∙бесплодие не установленной или неясной этиологии;

∙бесплодие, обусловленное цервикальным фактором (при безуспешности лечения путем внутриматочной инсеминации);

∙абсолютное бесплодие, обусловленное отсутствием или функциональной неполноценностью яичников (дисгенезия гонад, преждевременная менопауза, ареактивные яичники, синдром лютеинизации неовулирующего фолликула), в этих случаях ЭКО и ПЭ будет включать использование донорских ооцитов.

110