Хроматография

41

раз мер пластин, толщ инуслоя сорбента, объем пробы , д линупути фронта растворителя и д ругие факторы . П ри соблюд ении станд артны х услов ий

совпад ение Rf компонента пробы и од ногоиз св ид етелей д ает основания д ля отожд ествления в ещ еств. Н есов пад ение Rf указ ы в ает наотсутствие в пробесоответств ующ егокомпонента.

К ачественны й состав пробы в метод е бумажной хроматографии так же, как и в Т СХ , может бы ть установ лен или поспецифической окраске

непосред ственном опред елении на пластинке из меря ют площ ад ь пя тна и поз аранее построенномуград уировочномуграфикунаход я т количеств о

пя тна и интенсив ностьегоокраски), или пометод ув ы мы в ания . Н еред ко хроматограмму раз рез ают на отд ельны е части по числу пя тен, кажд ое пя тно обрабаты в ают соответствующ им э кстрагентом и опред еля ют количество э кстрагированного в ещ ества любы м под ход я щ им метод ом (фотометрическим, поля рографическим ит.д .).

Ла б ора торна я ра б ота № 1.

О п ре де ле ни е п ри ме си ги дра зи на в и зони а зи де (ги дра зи де ки слот ы и зони кот и новой ) ме тодом хрома тогра фи и

в тонкомслое сорб е нта (ТС Х )

Ц е льра бот ы : приобретение навы ков работы с оборуд ов анием д ля тонкослойной хроматографии; оз накомление с приемами качественной и

42

количественной обработки хроматограмм, полученны х на пластине д ля Т СХ .

О борудова ни е и ре а кт и вы :

1. К амерад ля Т СХ спритертой кры ш кой.

2.М икрош прицы на10 мкл.

3.М ерны еколбы емкостью 10 мл.

4.М ерны й цилинд ремкостью 25 мл.

5. П ластины д ля Т СХ «Силуфол».

6.П ульвериз атор.

7.Т ермостатв оз д уш ны й (t=105 оС).

8.В есы аналитические.

9. К алька, миллиметровая бумага, линейка, лупа с д еления ми, каранд аш .

10.И з ониаз ид , С5Н 4NCONHNH2 (технический). 11.Гид раз инасульфат, (N2H6)SO4 («хч» или«чд а»). 12.А цетон, CH3COCH3 («ч»).

13. п-Д иметиламинобенз альд егид ,(СH3)2NC6H4CHO, 1%-ны й раств ор в 95%-ном э тиловом спирте.

Вы полне ни е ра бот ы

П риготовлениеэ люентаипод готовкакамеры д ля Т СХ Х роматографирование провод я т в специальны х камерах д ля Т СХ –

стекля нны х круглы х или пря моугольны х емкостя х с притертой кры ш кой. Н ад нокамеры наливаютпод в ижную фаз у– э люент. Э люентом в д анной работе я вля ется смесьацетон – вод ав соотнош ении 49:1. Смесьготов я тв колбе с притертой пробкой смеш ением 24,5 мл ацетона и 0,5 мл в од ы (можноприготов итьсраз ув камере и перемеш ать). В ы сотаслоя э люентав

цилинд ром 15 млацетонаи15 млвод ы , всехорош оперемеш ивают.

Приготовлениераств ораисслед уемоговещ ества(из ониаз ид а)

Навескуиз ониаз ид амассой 1 г, вз я тую сточностью д о0,01 гвнося т

вмерную колбу емкостью 10 мл и д ов од я т д о метки приготов ленны м

растворителем (смесью ацетон-вод а). П олученны й раств ор тщ ательно перемеш ивают.

П риготовлениестанд артногораств орапримеси Н авеску гид раз ина сульфата массой 0,05 граств оря ют в мерной

колбе емкостью 10 млв смесиацетон-в од а1:1. П олученны й растворимеет концентрацию погид раз инусульфату0,5 %.

линия наз ы вается «линией старта». Н алиниистартакаранд аш ом намечают 4 точки, равноотстоя щ ие д руготд ругаиоткраев пластины . Ж елательно,

2 мкл раств орапримеси (гид раз инасульфата), чтоэ квивалентно2,5; 5,0 и

10мкггид раз инасоответственно.

Нанесение проб провод я т легким прикосновением вы д ав ленной из

иглы капли к точке на пластине. Н ужны й объем нанося т не сраз у, а в несколькокасаний так, чтобы д иаметр получивш егося напластине пя тна бы л как можноменьш е и не превы ш ал 0,5 см. П осле кажд огокасания пя тнопод суш ивают и только после э тогонанося т след ующ ую порцию раствора.

К огд а все 4 пробы буд ут нанесены и пя тна под сохнут, пластина готовад ля пров ед ения хроматографирования .

Провед ение хроматографирования

Пластинус нанесенны ми пробамипомещ аютв камеруд ля Т СХ так,

чтобы линия старта с нанесенны ми пя тнами бы ла в ы ш е уров ня э люента. К амеруз акры ваюткры ш кой и жд ут, когд а э люент под нимется примерно на 2/3 вы соты пластины . П ластину в ы нимают из камеры , отметив каранд аш ом вы сотупод ъемафронтаэ люента, исуш атнавоз д ухе.

П роя в ление хроматограммы Д ля проя вления з онкомпонентов пластинуобрабаты ваютреагентом

д иметиламинобенз альд егид ав 95%-ном э тиловом спирте. П ослеобработки

о

пластинусуш атпри температуре 100-105 Св термостате в течение 5 мин. Зоны анализ ируемоговещ ества и примесей проя вля ются на пластине в

вид е пя тенкирпично-красногоцвета.

Качественная обработкахроматограммы

Н а хроматограмме анализ ируемого вещ ества обнаружив ается не менее д в ух пя тен. О д но из них д олжно соответствовать основ ному в ещ еству– из ониаз ид у. В торое– примесигид раз ина.

П ровод я т качественны й анализ хроматограммы – ид ентифицируют з оны основноговещ естваипримесиповеличине Rf. Rf в сех проя вив ш ихся з оннахроматограмме рассчиты ваюткак отнош ение вы соты под ъемаз оны компонента (расстоя ние от линии старта д о центра пя тна) к в ы соте под ъема фронтаэ люента (расстоя ние от линии старта д олинии фронта). В ы соты из меря ют линейкой и в ы ражают в од инаковы х ед иницах д лины

44

(см илимм). Сов пад ениеRf од ной из з онанализ ируемоговещ ествасRf з он

хроматограмме основ ного вещ ества и на хроматограммах станд артны х образ цов примеси. О ценкупровод я тпосовокупностираз меров пя тен и их

гид раз инав образ це, оценивая площ ад ихроматографических з он. П лощ ад ь

хроматограмме и построение град уировочной з ависимости в коорд инатах √s-lg gr д ля станд артны х образ ов гид раз ина.

П лощ ад и з он из меря ют след ующ им образ ом. Н а хроматограмму наклад ы вают лист кальки и очерчивают контур интересующ их нас з он (пя тен гид раз ина в станд артны х и исслед уемом образ це). П олученное на кальке из ображение наклад ы вают з атем на миллиметровую бумагу и под считы ваютплощ ад ьпя тен(S) в мм2. Строя тграфик з ависимости √s отlg gr (количествагид раз инав станд артах).

Зная площ ад ь пя тна гид раз ина в опред еля емом образ це пографику наход я тlg gr и з атем gr в нем, гд е gr – количествогид раз инав пробе, мкг. Д алее рассчиты в аютсод ержание гид раз ина в из ониаз ид е в процентах как бы ло описано в ы ш е. И спольз ование з ависимости √s-lg gr поз воля ет

45

получить д остаточноточны е рез ультаты , ош ибка опред еления состав ля ет примерно5 %.

Ла б ора торна я ра б ота № 2.

Ц е льра бот ы : количественное опред еление ионов никеля в растворе метод ом бумажной хроматографии.

При боры и ре а кт и вы :

1. Х роматографическая камера.

2. Х роматографическая бумага (фильтровальная бумага марки

“синя я лента”, пропитанная раствором д иметилглиоксима)

3.М икрош приц.

4.Раств оритель: 12%-ны й растворглицерина.

5.Раств оры нитратаникеля , Ni(NO3)2, сконцентрацией от0,05 д о

0,25 мг-э кв/л.

Вы полне ни е ра бот ы

Л ист фильтровальной бумаги марки «синя я лента» пропиты в ают

интервале концентраций от 0,05 д о0,25 мг-э кв/л и раств оры соли никеля неиз вестной концентрации. Бумагупросуш иваютнавоз д ухе ипомещ аютв камеруд ля раз в ития хроматограмм.

К амера пред став ля ет собою стакан емкостью 500 мл, на д но которогоналиваютпод вижную фаз у– 12%-ны й раствор глицеринав вод е. П олоскубумаги з акрепля ютв ш тативе иопускаютв раствор глицеринад о линии погружения . Раз витие хроматограммы происход ит в течение 20-30

коорд инатах количеств о вещ еств а - в ы сота пика (рис. 7), по которому наход я тнеиз вестную концентрация анализ ируемогораств орасолиникеля .

46

Ла б ора торна я ра б ота № 3.

Ка ч е стве нное оп ре де ле ни е а ми ноки слот в б е лковомги дроли за те

д обавкой в животнов од стве. П род олжительностьитехнические параметры гид ролиз а (д ав ление, температура), а также состав , норма и рацион кормовы х д обавок з авися т от аминокислотного состав а белкового гид ролиз ата. У становление качественногосостав а белковогогид ролиз ата

При боры и ре а кт и вы :

1.Х роматографическая камера

2.Х роматографическая бумага, в атман№ 1.

3.М икропипеткаемкостью 0,1 мл.

4.П ульвериз атор.

47

5.П инцет.

6.Суш ильны й ш каф.

7.Раств оритель: смесь бутиловогоспирта с уксусной кислотой и

д истиллированной вод ой в объемном соотнош ении4:1:5.

8.П роя в итель: 200 мгнингид рина в 100 млацетона.

хроматографической бумаги д линой 30 см и ш ириной, соответствующ ей

микропипеткой путем прикосновения к бумаге в д ваприемапо0,005 млв од нуитужеточку. Д иаметркаплинабумагене д олженпревы ш ать3 мм.

Х роматограммы под суш ивают в суш ильном ш кафуи помещ ают в

д вижения растворителя и помещ ают в суш ильны й ш каф (70 оС) на 10-15

сиренев о-фиолетовогоцветананекотором расстоя ниид руготд руга.

К ачеств енны й анализ аминокислот провод я т путем сопоставления

положения пя тен станд артны х растворов аминокислот и анализ ируемого

э ксперимента имеет постоя нную величинуRf. Срав нение э тих в еличин, характериз ующ их смещ ениез онаминокислотстанд артны х раств оров и

48

полученны е при хроматографировании белков огогид ролиз ата, поз воля ет сд елатьв ы в од окачественном состав егид ролиз ата.

Рис. Х роматограмма качеств енного опред еления аминокислот метод ом бумажной хроматографии.

Ла б ора т орна я ра б ота № 4.

Коли ч е стве нное оп ре де ле ни е а спа ра ги новой , глут а ми новой ки слот и ва ли на в б е лковомги дроли за те ме тодомб ума ж ной

хрома т огра фи и

Ц е ль ра бот ы : раз д еление и количественное опред еление аминокислотв белковом гид ролиз ате метод ом нисход я щ ей хроматографии

постоя нны й и над ежны й контроль з а составом белков ы х гид ролиз атов. А нализ основ ан на раз д елении компонентов вслед ств ие их раз личны х скоростей перемещ ения по хроматографической бумаге. К оличественно аминокислотопред еля ютфотометрически после перевед ения компонентов в э танольны й раств ор. В качестве фотометрическогореактив априменя ют сульфатмед и(II).

При боры и ре а кт и вы :

3.П ульвериз атор.

4.М икропипеткаемкостью 0,1 мл.

5.П робиркиемкостью 30 мл.

6.Ф отоэ лектроколориметр

7.К юветы столщ иной поглощ ающ егослоя 1 см.

8.А налитические весы .

9.Суш ильны й ш каф.

10.Э тиловы й спирт, 96 %-ны й раствор.

49

11.8-гид роксихинолин: 0,1 гпрепарата растворя ют в 100 мл смеси бутилов огоспиртасуксусной кислотой ивод ой (4:1:2).

12.Раств оритель: смесь бутиловогоспирта с уксусной кислотой и вод ой в объемном соотнош ении4:1:5.

13.П роя в итель: 200 мгнингид ринарастворя ютв 100 млацетона. 14.Э люент: 10 млрастворасульфатамед ис массовой д олей 0,005 %

в э тиловом спирте раз бавля ют90 млэ тиловогоспирта, получают раств орсульфатамед исмассовой д олей 5×10-4 %.

аминокислотприменя ютбумагу, пред варительнообработанную раствором 8-гид роксихинолина (при э том уд аля ются след ов ы е количества катионов

(работаютв в ы тя жном ш кафу!), помещ аютв хроматографическую камеру, з акрепля ютод инконецв кюветеспод в ижны м растворителем (э люентом).

М икропипеткой нанося тнабумагу(5, 10, 15, 20)×10-3 млстанд артны х растворов аминокислотпорция миобъемом по5×10-3 млнарасстоя нии5 см открая с таким расчетом, чтобы кажд ая точки град уиров очногографика соответствов ала0,05; 0,10; 0,15 и 0,20 мгаминокислоты . Раствор нанося т

з атем хроматограмму в ы суш ив ают и вторично пропускают через нее

50

под вижны й растворитель. Т аким образ ом, хроматограммуобрабаты вают3 раз а.

контрольны е участки, не сод ержащ ие аминокислоти рав ны е поплощ ад и з онам опред еля емы х соед инений. В ы рез анны е участкибумаги из мельчают ножницами и помещ ают в пробирки. В кажд ую пробиркуд обавля ют по 10 млэ люента, объем д овод я тд о20 млэ тилов ы м спиртом и встря хивают. Э люиров ание происход ит в рез ультате образ ования комплексного соед инения аминокислот с Cu(II) оранжевого цвета, растворимого в э тиловом спирте. П робирки сэ люатами помещ аютв з атемненное местои

реш алась она из -з а несоверш енства и труд оемкости сущ ествовав ш их д о в торой полов ины Х Х в. метод ов раз д еления крайне мед ленно. Реш ение проблемы в ы д еления инд ивид уальны х природ ны х соед инений в качеств е лекарственны х вещ еств из природ ны х источников сы рья и проблемы контроля чистоты поя в ивш ихся в конце Х IX – начале XX в . синтетических лекарственны х препаратов также сущ ественносд ерживалось отсутств ием универсальны х метод ов раз д еления сложны х смесей органических соед инений.