Методичка

Зміст

РОЗДІЛ 1. КЛІТИННА БІОТЕХНОЛОГІЯІ БІОІНЖЕНЕРІЯ

РОЗДІЛ 1. КЛІТИННА БІОТЕХНОЛОГІЯ І БІОІНЖЕНЕРІЯ

БІОТЕХНОЛОГІЧНА ЛАБОРАТОРІЯ: КІМНАТИ ТА ОБЛАДНАННЯ

Біотехнологічна лабораторія укомплектована спеціальними приміщеннями і обладнанням.

1. Кімната для миття посуду оснащена раковинами із кислотостійкого матеріалу, дистилятором, миєчними машинами, стелажами та шафами для сушіння посуду.

2.Кімната для приготування середовищ забезпечена технічними, аналітичними, торзійними вагами, рН-метром, бідйстилятором, холодильними камерами, лабораторними столами, шафами для зберігання чистого посуду.

3.Приміщення для стерилізації поживних середовищ, інструментів, посуду, оснащене горизонтальними або вертикальними автоклавами, сушильною шафою з режимом роботи 160 - 180°С.

4.Операційна (асептична) кімната забезпечена ламінар-боксами

івикористовується для ізолювання та пересадки тканин і рослин.

5.Світлова культуральна кімната з кондиційованим повітрям, температурою 25 - 26°С, відносною вологістю 70 - 80%, 14-годинним фотоперіодом, оснащена стілажами і використовується для вирощування рослин-регенерантів.

6.Центрифужна кімната, оснащена мініта ультра-центри-

фугами.

7.Темнова культуральна кімната з кондиційованим повітрям, температурою 25 - 26°С, відносною вологістю 70 - 80%, оснащена установками ротаційного та шейкерного типу і використовується для вирощування калюсних культур та клітинних суспензій.

ПОСУД, ІНСТРУМЕНТИ ТАМАТЕРІАЛИ.

Для роботи з культурами тканин при приготуванні поживних середовищ необхідно мати: колби мірні (0,5 -5 л), стакани хімічні (0,05 - 1 л ) , циліндри мірні (0,1-2 л), піпетки Мора (1 - 10 мл), автоматичні піпетки (0,01 - 5 мл), піпетки градуйовані (1 - 10 мл), мікропіпетки градуйовані (0,1 - 0,5 мл), лійки, скляні палички різних розмірів, фільтри Зейтца (металеві) з прокладками із мембранних фільтрів "Синпор" або мембранні фільтри (наприклад "Millipore", "Sartorius").

7

Посуд для вирощування ізольованих тканин: колби Ерленмеєра (50 - 250 мл), чашки Петрі (високі і низькі, різного розміру), пробірки біологічні, флакони пеніцилінові, стакани, фарфорові склянки.

Інструменти для ізолювання і посадки тканин: пінцети анатомічні різних розмірів (20, 25 і ЗО см), скальпелі анатомічні, ножиці, спиртівки.

Матеріали: фільтрувальний папір, вата, марля, ізатні пробки, алюмінієва фольга для виготовлення ковпачків на колби, флакони, пробірки, в яких культивуються рослини або тканини.

Тема І. ТЕХНІКА КУЛЬТИВУВАННЯ РОСЛИННИХ КЛІТИН І ТКАНИН В УМОВАХ IN VITRO НА ШТУЧНИХ ПОЖИВНИХ СЕРЕДОВИЩАХ

Робота 1. Методи стерилізації рослинних об'єктів і обладнання при проведенні робіт з культурою ізольоеаних клітин і тканин рослин

Основною умовою успішного культивування ізольованих клітин, тканин, органів рослин є стерильність поживного середовища, посуду, матеріалів, інструментів, посадкового матеріалу, приміщення.

Стеуилізаиія приміщення:

1)Підлогу кімнати миють водою з будь-яким миючим засобом.

2)Проводять стерилізацію кімнати ультрафіолетовим опроміненням, використовуючи лампи ПРК-7 (потужність 1000 Вт) або ПРК- 4 (потужність 500 Вт) протягом 1,5-2 годин, в залежності від потужності ламп. Працювати в кімнаті можна через 2 години після виключення ламп.

Стеуилізаиія ламінар-боксу: ламінар-бокси, як правило, обладнані УФ лампами, які можна залишати на ніч ввімкну гими для стерилізації внутрішньої поверхні. Крім того, перед роботою робочу поверхню ламінар-боксу протирають 96° етиловим спиртові.

Стерилізаиію рук проводять з допомогою 96° етилового спирту, попередньо вимивши їх мильним розчином.

Стерилізаиію інструментів: ножиці, ланцети, г інцети, голки прожарюють в сушильній шафі протягом 2 - 3 годин прл температурі 160 - 180°С. Перед роботою інструменти стерилізують 96° спиртом і обпалюють над полум'ям спиртівки. Після цього їх поміщають на підставку для охолодження і використовують тільки для однієї маніпуляції. Перед повторним використанням інструментів, повторюють їх стерилізацію в полум'ї спиртівки.

8

Стерилізація посуду: весь посуд миють кислотним або лужним методом, промивають проточною водою, споліскують 2 рази дистильованою водою і один раз - бідистилятом. Після висихання посуд прожарюють з сушильній шафі при температурі 160 - 180°С протягом 2 —' 2,5 годин. Посуд ще можна автоклавувати, попередньо загорнувши його в пергаментний папір. Стерильний посуд зберігають у закритих шафах, не доггускаючи забруднення навіть слідами хімічних речовин.

У випадку, коли культуральні рослини або клітини виявились інфікованими, то перед їх знищенням та наступним миттям посуду, їх автоклавують при тиску 2 атм протягом 50 - 6 0 хвилин.

Стерил ізація поживного середовища: тверді (агаризовані) і рідкі середовища автоклавують в пробірках, колбах або іншому скляному посуді. Час, стерилізації залежить від об'єму середовища (табл. 1).

Складові поживних середовищ, які руйнуються чи коагулюють під час автоклавування (амінокислоти та їх аналоги, ферменти, мутагени) стерилізують механічним методом - через бактерицидні фільтри. Скляні фільтри після використання промивають концентрованою кислотою і кілька разів надлишком водопровідної і дистильованої води.

Стерші ізація рослинного матеріалу: одержання стерильного рослинного м атеріалу - складне завдання, тому що необхідно нейтралізувати мікрофлору та не пошкодити рослинну тканину. Для цього використовують різні стерилізуючи речовини, які не проникають у тканину і легво змиваються водою.

Враховуючи те, що в природних умовах на поверхні рослин знаходиться велика кількість грибів, їх спор, бактерій, рослинний матеріал занурюють в 70% етиловий спирт: насіння на 2 - 3 хвилини, меристеми листя на 0,5 - 1 хвилину.

Для подальшої стерилізації використовують такі препарати:

1. Препарати з активним хлором (0,5 - 5% гіпохлорид натрію, 9% гіпохлорид кальцію, хлорамін, "білизна");

9

2. Ртутні препарати (0,2-0,5% розчин сулеми, діодид, фапосепт); 3 . 5 - 20% пероксид водню, 1% бромна вода, 0,5 - 2% азотнокисле

срібло.

Для підвищення стерилізуючого ефекту в розчини необхідно додавати незначну кількість емульгатору твін-80 або твін-200 (1 крапля на 100 мл розчину).

Час стерилізації визначається експериментально і залежить від вибраної стерилізуючої речовини та об'єкту, який ми стерилізуємо.

Щоб видалити із тканин стерилізуючу речовину, промивання експланта проводять чотири рази з періодом експозиції 15 хвилин. При порушенні режиму відбувається отруєння культури, що призводить до заторможення ростових процесів або повної загибелі рослин.

У випадку значного зараження матеріалу при введенні в стерильну культуру необхідно застосувати антибіотики, їх розчини стерилізують через мембрані фільтри. Найбільш ефективним є клафоран. Для цього матеріал, який простерилізовано та відмито занурюють на 3 години у водний розчин клафорану (500 мг/л), а потім висаджують на агаризоване поживне середовище, яке містить 500 мг/л клафорану і 50 мг/л канаміцину.

Перед відкриванням колби чи пробірки з поживним середовищем їх протирають ватою, змоченою в спирті, горловину обпалюють над полум'ям спиртівки.

Проводячи посадку експлантів, колбу треба тримати під кутом поблизу полум'я спиртівки. Після посадки ковпачок із фольги або ватну пробку обпалюють і швидко закривають ним колбу чи пробірку.

Розрізання рослин зручно проводити в чашках Петрі або на стерильних салфетках із фільтрувального паперу.

Робота 2. Приготування поживних середовищ для культивування ізольованих клітин і тканин рослин

Поживне середовище - основний фактор успішного культиву- вання ізольованих органів, тканин і клітин рослин. Поживні середови- ща для культивування ізольованих клітин і тканин повинні включати

всі необхідні рослинам макроелементи: азот, фосфор, калій, кальцій, сірку; магній, залізо і мікроелементи: бор, цинк, мідь, кобальт, марга- нець, йод, молібден, а також вітаміни, вуглеводи, фітогормони. Деякі поживні середовища включають гідролізат казеїну; певні амінокисло- ти. Крім того, в склад поживних середовищ входить ЕДТО (етиленди- амінтетраоцтова кислота) або її натрієва сіль, які покращують доступ заліза для клітин в широких межах рН. Середовища за консистенцією бувають тверді або агаризовані і рідкі в залежності від цілей

10

досліджень. Для приготування твердих поживних середовищ використовують агар-агар - це полісахарид, який отримують із морських водоростей. Желатинові середовища непридатні для культури, оскільки желатина токсична для рослинних тканин. Зазвичай для одержання твердого поживного середовища додають 0,5 — 0,7% агару.

Мета роботи: приготувати маточні розчини мікро-, макросолей, вітамінів, регуляторів росту, Fe-хелату та поживні середовища МурасігеСкуга, Уайта, Гамборга, Міллера для подальшого культивування на них ізольованих тканин, клітин та органів рослин.

Матеріали і обладнання: макрота мікро солі, вітаміни, регулятори росту, спирт, ваги, шпателі, плитка, лабораторний посуд, 1н НСІ і 1н КОН, магнітний змішувач.

ХІД РОБОТИ:

1. Для зручності приготування поживних середовищ в мірних колбах готують маточні розчини макроелементів, концентрація яких в 10 разів перевищує робочу концентрацію, згідно прописам, зважуючи і розчиняючи окремо кожну наважку солі в новій порції дистильованої або бідистильованої води. Зберігають їх в холодильній камері при температурі +4°С протягом шести місяців або при кімнатній температурі в темному місці попередньо проавтоклавувавши їх.

2. Маточні розчини мікроелементів готують в концентраціях в

100 разів перевищуючи необхідну. Зберігають їх в холодильній камері при температурі +4°С в посуді з темного скла протягом 6 місяців.

3. Розчини фітогормонів готують таким чином;

—ауксини:

>2,4-Д - дихлорфеноксіоцтова кислота;

>ЮК - індолілоцтова кислота;

>ІМКіндолілмасляна кислота;

>НОК - нафтилоцтова кислота;

>піклорам;

розчиняють 100 мг речовини в 0,5 - 2 мл етанолу, підігрівають, додають води до 100 мл (концентрація 1 мг/мл);

—цитокініни:

>Кін-кінетин;

>Зеа-зеатин;

>б-БАП-б-бензиламінопурин;

розчиняють 100 мг речовини в 2 мл 0,5 НСІ, підігрівають, доводять водою до 100 мл.

—гібереліни:

>ГК - гіберелова кислота;

11