Методичка

Дуже важливе значення відіграють компоненти насіннєвого зачатку, з яких розвивається зародок.

Найкращим вважають стан зародкового мішка, при якому повністю відбувається віддиференціювання гаплоїдних елементів (яйцеклітини, двох синергід і трьох антиподів), потенційна тотипотентність яких може бути реалізована у вигляді зародків або калюсної тканини. Технологія одержання гіногенетичних гаплоїді з розроблена і використовується для цукрових буряків, соняшнику, пшениці та інших культур.

У покритонасінних рослин мегаспорогенез (розвиток насіннєвого зачатку і зародкового мішка проходить відносно швидко - за кілька днів і навіть годин з однієї материнської археспорбальної клітини нуцелуса шляхом 5-6 поділів утворюється готовий до запилення зародковий мішок.

Мета роботиг одержати гаплоїдні рослини з жіночого гаметофіту Матеріали і обладнання: квіткові бруньки цукрових буряків, стерилізуючі розчини (70% етанол, розчин діоциду), стерильна дистильована вода, стерильні пінцети, ланцети, поживні середовища, мікроскоп, ламінар-бокс.

ХІД РОБОТИ:

1.За 2 - 3 дні до початку цвітіння проводять кастрг цію материнської рослини - видаляють маточку.

2.Стовпчик маточки стерилізують розчином діоциду з наступним трьохразовим промиванням в стерильній воді.

3.Стерильним пінцетом стовпчик маточки переносять у пробірки на поживне середовище для індукції органогенезу.

4.Пробірки з рослинним матеріалом культивувують в світловій культуральній кімнаті при при температурі 27°С, фотоперіоді 14 годин.

5.Через 25 - ЗО днів проводять візуальне визначення частоти утворення калюсу та морфологічних структур на експлантах (табл. 7).

32

Робота 16, Іїмбріокультура

На даний момент, коли достатньо глибоко досліджена морфологія ембріон,гпьного процесу покритонасінних рослин, виникла можливість вивчити його фізіолого-біохмічні можливості для розшифровки механізму диференціації тканин і репродуктивних органів, що, в свою чергу, дозволить ближче підійти до управління ембріогенезом. Викликають Інтерес дослідження по вивченню індукції соматичних зародків в калюсній культурі і одержання з них нормальних рослин. Досконалення методу культури ізольованих зародків сприяє широкому використанню його в біологічних дослідженнях, в тому числі в селек- ційно-генетичних. Особливо ефективний г(ей метод при вирощуванні рослин із МОЛІ ^життєздатних, абортивних зародків, які утворюють- ся при схрещуванні географічно і генетично віддалених форм. Таким чином, виникає можливість одержання нових форм і сортів"сільськогосподарський: рослин, виведення яких без використання культури зародків виключено. Це сприяє поповненню генофонду культурних рослин.

Мета роботи: розробка методичних прийомів для культивування ізольованих незрілих зародків цукрових буряків.

Матеріали і обладнання: насіння цукрових буряків, 0,5% розчин сулеми, стерши.на дистильована вода, стерильні пінцети, ланцети/ поживні середонища.

ХІД РОБОТИ:

1.Насіння цукрових буряків стерилізують 0Д% розчином сулеми протягом 20 хв.

2.Надалі насіння по 20 - 25 шт поміщають у стерильні чашки Петрі із зволоженим паперовим фільтром і залишають на ніч для набубнявіння.

3.Зародки вичленяють із насіння.

4.Дослідний матеріал стерилізують 0,5% розчином сулеми і п'ятикратно відмивають стерильною дистильованою водою.

5.Стерильним пінцетом зародки переносять у стерильні чашки Петрі з проавтоклавованими паперовими фільтрами.

6.Стерильним пінцетом зародки переносять у флакончики на поживне саредовище.

33

рН 5,6 до автоклавування

7.Ізольовані незрілі зародки витримують протягом перших 10 діб при температурі 10-12°С з постійним освітленням (1,2-1,4 клк), надалі культивують при температурі 26°С і 16-годинному фотоперіоді (1,2 клк).

Тема VI. ЗАСТОСУВАННЯ МЕТОДУ КУЛЬТУРИ ТКАНИН У СЕЛЕКЦІЇ РОСЛИН

Успіхи, досягнуті в області культивування рослинних клітин, відкрили нові потенційні можливості використання рослинного матеріалу для вирішення фундаментальних питань експериментального мутагенезу і селекції нових форм рослин. Вихідним матеріалом для мутагенезу та селекції можуть бути калюсні "і суспензійні культури, ізольовані протопласти, соматичні або андрогенні ембріоїди, сегменти листків і меристем,

Для відбору мутантів використовують такі прийоми:

•Пряму або позитивну селекцію, при якій виживають тільки мутантні клітини певного типу.

•Непряму (негативну) селекцію, основану на вибірковій загибелі клітин дикого типу, які діляться, і виживанні метаболічно неактивних клітин. Потребує додаткової ідентифікації у них мутаційних змін.

•Тотальну селекцію, при якій індивідуально тестуються всі клітинні клони.

•Візуальну селекцію і неселективний відбір, коли варіантна лінія може бути ідентифікована серед популяції візуально або при використанні біохімічних методів.

Робота 17. Одержання клітинних клонів стійких до посухи

Мета роботи: отримання клітинних колоній стійких до поліетиленгліколю(ПЕГ).

Матеріали і обладнання: ламінар-бокс, стерильні піпетки, чашки Петрі з селективним середовищем, клітинні суспензії.

34

ХІД РОБОТИ:

1 . 1 мл клітинної суспензії, отриманої із мезофілу листків тютюну, висівають на вихідні середовища з різними концентраціями ПЕГ: 5%, 10%, 20%, 30%, 40%. Наявність в поживному середовищі ПЕГ як непроникної неметаболізуємої осмотично активної речовини краще всього моделює умови посухи

рН 5,0-5,5 до автоклавування

2.Чашки Петрі з висіяною суспензією поміщають в термостат для утворення калюсної тканини.

3.Ділянки калюсу з мутантними клітинами виявляють за їхнєю здатністю до росту. Результати записують у таблицю 8.

Таблиця 8. Концентрація ПЕГ в поживному Приріст маси, %

середовищі, %

5%

10%

20%

30%

40%

4.Колонії клітин відділяють від решти і розмножують на цих же середовищах, перевіряючи їх тим самим на стійкість, а потім регенерують на середовищі з ПЕГ до цілих рослин.

5.В подальшому рослини доцільно підтримувати на середовищі з ПЕГ для запобігання химеризації.

35

Робота 18, Одержання клітинних клонів стійких до хлоридного та сульфатного засолення грунту

Мета роботи: отримання клітинних колоній стійких до NaCl, Na2S04. Матеріали і обладнання: ламінар-бокс, стерильні піпет си, чашки Петрі з селективним середовищем, клітинні суспензії.

ХІД РОБОТИ:

1. 1 мл клітинної суспензії, отриманої із мезофілу листків тютюну, висівають на вихідні середовища з різними концентраціями NaCl: 1,5%, 2,0%, 2,5% TaNa2S04: 1,5%, 2,0%, 2,5%, 3,0%.

рН 5,0-5,5 до автоклавування

2.Чашки Петрі з висіяною суспензією поміщають в термостат для утворення калюсної тканини.

3.Ділянки калюсу з мутантними клітинами виявляють за їхнєю здатністю до росту. Результати записують у таблицю 9.

36

4.Колонії клітин відділяють від решти і розмножують на цих же середовищах, перевіряючи їх тим самим на стійкість, а потім регенерують на середовищі з NaCl, Na2S04 до цілих рослин.

5.В подальшому рослини доцільно підтримувати на середовищі з NaCl, Na2S04 для запобігання химеризації.

Тема VII. КЛОНАЛЬНЕ МІКРОРОЗМНОЖЕННЯ РОСЛИН

Мікроклональне розмноження рослин ~ це безстатеве вегетативне розмноження в культурі in vitro, за якого отримують рослини генетично ідентичні вихідній батьківській формі. Весь процес мікроклонального розмноження ділиться на 4 етапи:

1)Введення і; стерильну культуру донорських експлантів.

2)Власне мікророзмноження, тобто збільшення кількостей ініціалей на експланті, утворення з них пагонів, висадка бруньок на поживні середовища для збільшення їх кількостей.

3)Укоріненн і розмножених пагонів і депонування їх в прохолодному приміщень і.

4)Переведення стерильної культури в нестерильні умови та висадка в грунт.

Порівняно з традиційними методами розмноження, які використовуються в сільськогосподарській практиці, мікроклональне розмноження має ряд переваг:

>коефіцієнт розмноження значно вищий (з однієї бруньки протягом року можн і отримати 5000 - 10000 рослин-регенерантів);

>можливість підтримувати ріст рослин протягом всього року; велика кількість рослин може рости на відносно невеликій лабораторній площі;

>оздоровлення рослин від вірусів і патогенних мікроорганізмів, формування р ослин-донорів;

>можливість вести відбір рослин з селекційно-цінними ознаками;

>довгострокове збереження рослин у пробірках при низьких температурах, що дозволяє створювати банк цінних генотипів і по мірі необхідності включати в селекційний процес.

Основними факторами, що впливають на процес мікроклональ-

ного розмноження є фізіолого-біохімічний стан експланта, склад поживного середовища і умови культивування.

37

Рис. 1. Схема клоиальиого мікророзмноження рослин методом активації розвитку існуючих меристем (І шлях), індукція виникнення адвентивних бруньок на експланті (II шлях):

1 - вибір вихідного експланта; 2 - одержання стерильної культури; З - утворення адвентивних бруньок безпосередньо на первинному експланті; 4 - ріст бруньок і формування мікроцагонів; 5 - розмноження мікропагонів (живцювання); 6 - укорінення мікропагонів; 7 - депонування рослин-регенрантів при пониженій температурі; 8 - перенесення рослин у тепличні умови; 9 - висадження рослинрегенерантів в поле.

38

Робота 19. Виділення і культивування апікальних меристем картоплі

Апікальна меристема - це ділянка стеблового апексу, яка розміщена дистально по відношенню до найбільш молодого листкового примордія і являє в середньому 80 мм в довжину. Культура апікальних меристем широко використовується для створення рослинного матеріалу вільного від патогенів.

Мета роботи оволодіти методикою виділення апікальних меристем та їх культивування.

Матеріали і с бладнання: ламінар-бокс, бінокулярна лупа, інструменти (ланцети, пінцети), чашки Петрі, флакони з поживним середовищем, спиртівка.

ХІД РОБОТИ

1.Бульби картоплі зберігають при температурі 4 - 6°С, потім пророщують в темряві при температурі 20 - 22°С.

2.Проростки картоплі стерилізують в розчині "Білизни" (концентрація 1:3) протягом 15 хв. Потім проростки промивають тричі в стерильній дистильовані воді по 10 хв в кожній порції води.

3.Простерилізовані проростки поміщають у стерильну чашку Петрі і додають декілька крапель стерильної води для попередження їх підсихання.

4.Перед в й ч л є н є н н я м з верхівки проростків видаляють покривні листочка, послідовно звільняючи бокові і верхівкові меристеми з примордіальними листками. Цю операцію проводять з допомогою препарованої голки під бінокулярним мікроскопом

5.Після вичленення меристему на кінчику голки переносять на поверхню поживного середовища Мореля в пробірки.

Склад поживного середовища для культивування апікальних меристем картоплі (мг/л):

39

6.Закривають пробірку пробкою над полум'ям горілки і ставлять в штатив. Штатив з пробірками переносять в світлову кімнату і культивують при температурі 25 - 28°С.

Робота 20. Клональне мікророзмноження картоплі черенкуванням

Розмноження рослин черенкуванням основано на подоланні апікального домінування та активації пазушних меристем при видаленні верхівки пагона. При поміщенні черенка на поживне середовище із пазушної бруньки розвивається пагін. Кожне наступне черенкування проводять через 14 - 21 день. Із однієї рослини отримують 5-8 черенків.

Мета роботи: оволодіти технікою мікророзмноження рослин. Матеріали і обладнання." ламінар-бокс, інструменти (ланцети, пінцети), чашки Петрі, спиртівка, пробірки з поживним середовищем, стерильні рослини-регенеранти.

ХІД РОБОТИ:

1.Стерилізацію рослинного матеріалу проводять за стандартною методикою, або використовують рослини вирощені в умовах in vitro.

2.Пагони розрізають на черенки довжиною 3 - 5 мм з однією пазушною брунькою (в випадку черенкування гвоздики) або двома (в випадку черенкування картоплі).

3.Мікрочеренки поміщають в пробірки на поживне середовище, яке містить:

рН5,6-5,8 до автоклавування

4.Культивування проводять на світлі при температурі +23 - 25°С, 14-годинному фотоперіоді, інтенсивності освітлення 1000 лк.

5.Черенки вкорінюються і дають пагони протягом 3 - 4 тижнів після введення в культуру.

40

Робота 21. Індукція кореневої системи і бульбоутворення при мікроклональному розмноженні картоплі

Мета роботи: оволодіти методикою вегетативного розмноження рослин in vitro.

Матеріали і обладнання: асептичні рослини картоплі, стерильне середовище у пробірках, стерильні чашки Петрі, скальпелі, пінцети, спиртівка.

ХІД РОБОТИ:

1.Пробірку з рослиною протирають спиртом і обпалюють горло у полум'ї спиртівки.

2.Стерильним пінцетом виймають рослину із пробірки, в якій вона росла, і поміщають її у стерильну чашку Петрі.

3.Підтримуючи рослину пінцетом, скальпелем розрізають стебло на сегменти довжиною приблизно 10 мм: частина над брунькою становить 2 - 3 мм, а під нею - 5 - 1 мм. Обрізають листки.

4.Пінцетом переносять кожний сегмент у пробірку з поживним середовищем.

5.Культивують при температурі 25 - 26°С, освітленні 2 - 3 клк, 16-годинному фотоперіоді, відносній вологості повітря 70-75%.

Робота 22. Індукція утворення адвентивних бруньок безпосередньо на гіпокотильних сегментах стерильних проростків соняшника

Індукція утворення адвентивних бруньок безпосередньо на первинному експланті також є ефективним методом тонального мік-

41