Методичка

генними. Фітогормони включають ауксини, цитокініни, гібереліни, абсцизову кислоту, етилен.

Робота 9, Ізольована тканина сої як тест-система на цитокініни

Калюсна культура сім 'ядолей сої дуже чутлива на дію цитокінінів. Відсутність в поживному середовищі цитокінінів призводить до зупинки росту калюсної культури, а введення їх в середовище відразу відновлює ріст калюсної тканини.

Мета роботи: отримати калюсну тканину сої на середовищах з різним вмістом цитокінінів.

Матеріали і обладнання: ламінар-бокс, інструменти (пінцети, ланцети), поживні середовища, чашки Петрі, стерильні сім'ядолі сої, спиртівка.

ХІД РОБОТИ:

1. Готують поживні середовища з різним вмістом цитокінінів. Автоклавують при 1 атм протягом 25 хвилин. Як контроль використовують безгормональне поживне середовище.

Склад поживних середовищ з різним вмістом регуляторів росту (мг/л)

рН 5,6-5,8

2.В ламінар-боксі висаджують раніше отриману калюсну тканину сої на поживні середовища з різним вмістом регуляторів росту.

3.Культивують калюсну тканину в термостаті при температурі +25 - 26°С, при відносній вологості повітря 60 - 70%, без доступу світла.

22

4.Через кожні 7 днів знімають ростові характеристики калюсних тканин (індекс росту, приріст тканини, сиру та суху вагу, проводять підрахунок клітин за методом Брауна).

5.В кінці досліду будують графіки дії цитокінінів на ріст калюсних тканин сої, відкладаючи на горизонтальній осі номери калюсів, на вертикальній - ростові характеристики.

Робота 10. Ізольована культура топінамбуру як тест-систе- ма на ауксини

Калюсна тканина топінамбуру чутлива до дії ауксинів, відсутність яких в поживному середовищі призводить до зупинки росту калюсу. Введення ауксинів в поживне середовище на якому культивуються експланти призводить до відновлення росту калюсних тканин. При вивченні ауксинової дії препаратів, необхідно в стандартному середовищі замінити ауксини на досліджуваний препарат і якщо калюсна тканина на такому середовищі росте, це буде свідчити про ауксинову дію препарату.

Мета роботи: отримання калюсної тканини топінамбуру на поживних середовищах з різним вмістом ауксинів.

Матеріали і обладнання: ламінар-бокс, інструменти (пінцети, ланцети), поживні середовища, чашки Петрі, калюсна тканина топінамбуру, спиртівка.

ХІД РОБОТИ:

1. Готують поживні середовища з різним вмістом ауксинів. Автоклавують їх при 1 атм протягом 25 хвилин. Як контроль, використовують безгормональне поживне середовище.

Склад поживного середовища з різним вмістом ауксинів (мг/л)

23

2.В ламінар-боксі висаджують раніше отриману калюсну тканину топінамбуру на поживне середовище з різним вміс том регуляторів росту.

3.Калюсну тканину культивують без доступу світла при температурі+26 - 28°С та відносній вологості 60 - 70%.

4.Через кожні 7 днів знімають ростові характеристики калюсних тканин (вагу, індекс росту, забарвлення, підрахунок клітин за методом Брауна).

5.В кінці досліду будують графіки впливу ауксинів на ріст калюсної тканини топінамбуру, відкладаючи по горизонтальній осі номери калюсів, а по вертикальній - ростові характеристики.

Тема IV. УПРАВЛІННЯ ПРОЦЕСАМИ РОСТУ ЗА ДОПОМОГОЮ ФІТОРЕГУЛЯТОРШ

Гібереліни стимулюють вегетативний ріст, активізують процеси розтягнення і ділення клітин, прискорюють проростання насіння, сприяють утворенню партенокарпічних плодів.

Цитокініни приймають участь в індукції клітинного ділення, затримують процес старіння, активізують диференціювання хлоропластів, індукують розвиток пазушних бруньок, регулюють ріст соматичних зародків.

Ауксини вводять для індукції клітинного ділення і диференціації. Вони активують утворення кореневих зачатків, регулюють соматичний ембріоногенез, регенерацію органів із калюсу експланта.

Абсцизини - їх дія пов'язана із спокоєм бруньок і насіння, опаданням квіток, плодів, старінням і дозріванням.

Етилен прискорює дозрівання плодів, стимулює опадання листя.

Робота 11. Індукція стеблового органогенезу в культурі калюсної тканини картоплі

При індукції органогенезу в культурі тканин розрізняють дві фази цього процесу. Перила фаза - дедиференціації, під час якої проходить перетворення спеціалізованої клітини в калюсну. Необхідною умовою для дедиференціації є перенесення ізольованої тканини на агаризоване або рідке середовище, яке містить елементи живлення та гормональні фактори. Друга фаза - диференціації, під час якої проходить формування зачатків органів.

Мета роботи: отримання із калюсної тканини рослин-регенерантів. Матеріали і обладнання: ламінар-бокс, інструменти (ланцети, пінцети), спиртівка, чашки Петрі, флакони з поживним середовищем, калюсна тканина картоплі.

24

ХІД РОБОТИ:

1.Роботу іроводять в ламінар-боксі. Стерильну калюсну тканину картоплі в чашці Петрі розділяють на декілька експлантів.

2.Експлант висаджують на регенераційне поживне середовище.

Склад поживного середовища для індукції стеблового органогенезу в культурі калюсної тканини картоплі (мг/л)

3.Калюс культивують при температурі +23 - 26 °С, інтенсивності освітлення 2000 лк, 14-годинному фотоперіоді.

4.Через тиждень відмічають появу глобул, а через 3 тижні - мерйстематичних зон яскраво-зеленого кольору.

Робота 12. Вплив аналогів ауксина на коренеутвореиня у стеблових ж ивців квасолі

Однією Із функцій фітогормона ауксина є стимулювання коренеутвореиня. .Але природний ауксин ~ індоліл-3-оцтова кислота (ЮК) - дуже швидко руйнується під дією світла. Тому для індукції коренеутвореиня використовують стабільні аналоги ауксина, такі як ІМК, НОК. Метод укорінення стеблових живців квасолі звичайної дозволяє легко, швидко і одночасно визначити активність цілого ряду фітогормонів, здатних стимулювати коренеутвореиня квасолі звичайної (Phaseolus vulgaris). Живці квасолі, які використовують для укорінення, це відрізки стебла з парою перших листків. Число коренів і дов-

25

жина ділянки стебла, на якій закладаються корені, може слугувати показником активності стимуляторів коренеутвореиня.

Коренеутвореиня у живців - складний інтегральний процес, в якому виявляється три фази росту клітин: ділення, розтягнення і диференціація. Число утворених коренів при укоріненні живців може свідчити про дію регуляторів росту на ділення клітин, а приріст довжини коренів - про вплив фізіологічно активних речовин на ріст в фазу розтягнення і на диференціацію клітин.

Мета роботи: вивчити вплив аналогів ауксинів на коренеутвореиня у стеблових живців квасолі.

Матеріали і обладнання: ламінар-бокс, інструменти (ланцети, пінцети), спиртівка, чашки Петрі, пробірочні рослини квасолі, флакони з поживним середовищем

ХІД РОБОТИ:

1.Пробірку з рослиною протирають спиртом і обпалюють горло у полум'ї спиртівки.

2.Стерильним пінцетом виймають рослину із пробірки, в якій вона росла, і поміщають її у стерильну чащку Петрі.

3.Підтримуючи рослину пінцетом, скальпелем розрізають стебло на сегменти довжиною приблизно 10 мм: частина над брунькою становить 2 - 3 мм, а під нею - 5 - 7 мм. Обрізають листки.

4.Пінцетом переносять кожний сегмент у пробірку з поживним середовищем (див. роботу 39).

5.Культивують при температурі 25 - 26°С, освітленні 2 - 3 клк, 16-годинному фотоперіоді, відносній вологості повітря 70-75%.

Робота 13. Взаємозв'язок дії фітогормонів на клітини рослин

Узагальнення сучасних уявлень про фізіологічну дію фітогормонів дозволяє говорити, гцо цитокініни найбільше пов'язані з діленням клітин; ауксини, гібереліни, брасиностероїди - із збільшенням розмірів клітин і їх диференціюванням; абсцизини — із станом спокою, а етилен - із дозріванням і старінням. Враховуючи те, що процес росту складається з трьох етапів - ділення клітин, їх розтягнення та диференціювання - необхідно обов 'язково підкреслити, що фітогормони викликають той чи інший фізіологічний ефект лише при спільній взаємодії.

Якщо один або декілька фітогормонів посилюють, доповнюють дію один одного і сумарний ефект дії набагато перевищує результат їх індивідуальних ефектів, то говорять про синергізм дії фітогормонів. Відповідно, результатом антогонізму взаємодії фітогормонів є гальмування процесів.

26

Реалізація томипотентності клітин значною мірою залежить від балансу регуляторів росту у поживному середовищі.

Мета роботи: вивчення взаємозв'язку дії фітогормонів на калюсну тканину.

Матеріали і обладнання: калюсна тканина: ріпаку, пшениці, флакони із стерильним поживним середовищем з різною концентрацією регуляторів росту, стерильні чашки Петрі, скальпелі, пінцети, спирт, спиртівка, ламінар-бокс.

ХІД РОБОТИ:

1.Стерильним пінцетом виймають калюс із флакону (ріпаку, пшениці) і переносять його у стерильну чашку Петрі.

2.Стерильним скальпелем розрізають калюс на невеликі шматочки.

3.Шматочки калюсу поміщають у флакони з середовищем із різним вмістом регуляторів росту.

Склад поживних середовищ з різним вмістом регуляторів росту

4.Флакони з рослинним матеріалом культивують у термостаті при температурі 25±1°С.

5.Через 25 - ЗО днів проводять облік росту калюсних тканин. Результати заносять в таблицю 5.

Таблиця 5.

27

Наявність фітогормонів у поживному середовищі: низьке значення співвідношення цитокінін/гіберелін.

Наявність фітогормонів у поживному середовищі: високе значення співвідношення цитокінін/ауксин

Наявність фітогормонів у поживному середовищі: високе значення співвідношення ауксин/цитокінін

Тема У. КУЛЬТУРА ІЗОЛЬОВАНИХ КЛІТИН І ТКАНИН В СЕЛЕКЦІЇ РОСЛИН

Культивування in vitro пиляків, пилку, ізольованих зародків, незапліднених насіннєвих зачатків дозволяє отримати гаплоїдні рослини та калюсні тканини, що має суттєве значення при вирішенні багатьох селекційно-генетичних програм. Особливий інтерес пов'язаний з можливістю їх досліджування як посередників при створенні подвоєних гаплоїдів (дигаплоїдів).

У гаплоїдів набагато легше виявити цінні мутації, а з допомогою колхіцину можна отримати повністю гомозиготні диплоїдні рослини. На сучасному етапі більш чим у ЗО видів можна отримати гаплоїдні рослини або тканини методом культури ізольованих пил яків та пилку. В умовах культури індукція до росту мікроспор та утворення ембріоїдів може проходити двома шляхами - прямим ембріогенезом або непрямим - через утворення калюсу та індукування в ньому органогенезу. В обох випадках даний процес здійснюється абсолютно відмінно від того як це проходить in vivo. Утворення гамет після 1 - 2 ділення блокується, а вегетативна клітина ділиться, як зигота і дає початок ембріонам. Перевага надається прямому андрогенезу, при якому мікроспора поводить себе як зигота і проходить цілий ряд етапів ембріогенезу, включаючи утворення на пиляку рослин. У випадку непрямого андрогенезу мікроспора дає початок калюсу, в якому починається утворення ембріоїдів. Іноді для індукції органогенезу калюс необхідно пересадити на інше середовище.

Відтворення ембріогенезу в контрольованих умопах є одним із шляхів повного пізнання процесів формування зародків на материнській рослині, вивчення тимчасової реалізації генетичної інформації геному в цей період; встановлення причин і умов клітинного ділення, диференціації, формоутворення і морфогенезу. Відомо, що період ембріонального розвитку організму відрізняється високою активністю процесів клітинного ділення та диференціації. Всі дослідження в

28

культурі зародків in vitro необхідно поділити на дві групи. В одних роботах в конгрольованих умовах проводиться вирощування зрілих, в основному сформованих зародків, в інших - зародків на ранніх етапах їх ембріонального розвитку.

Спонтанні гаплоїди у рослин виникають рідко. У природі існує явище семігамії (подвійних проростків), коли в одній насінині утворюється два або кілька зародків, один із яких буває гаплоїдним. Утворення гаплоїдів викликають затримки у запиленні або запилення пилком іншого вк ду рослин.

Метод in vitro дозволяє одержувати гаплоїди із чоловічого або жіночого гаметофіту наступними способами:

—культура пиляків і мікроспор (андрогенез)

—культура незапліднених зачатків (гіногенез)

—партеногенез після запліденення гаплоіндуктором (гаплопродюсером): використання віддаленої гібридизації з наступним вирощуванням зародку в культурі in vitro.

Зпрактичної точки зору селекціонери можуть використовувати гаплоїди у таких напрямах:

S Створення гомозиготних ліній в селекції на гетерозис і для різноманітних генетичних пошуків.

S Одержання триплоїдів (рослин з трьома наборами хромосом) у поліплоідних видів рослин з метою їх промислового використання.

S Подолання міжвидової несумісності (особливо у картоплі).

SЗастосування у поліплоїдних видів попередньої селекції на більш низькому рівні плоїдності. Наприклад, спочатку одержують гомозиготні диплоїдні лінії з цінними ознаками, які шляхом колхі-

цинування перетворять на більш високий рівень плоїдності.

SЗастосування гапдоїдів для одержання анеуплоїдів (з метою визначення локалізації генів і переміщення хромосом),

SГалоїди декоративних культур, що характеризуються дрібними квітками і тривалим цвітінням, яке зумовлене стерильністю, можуть знайти безпосереднє використання у квітникарстві.

VУ зв'язку з тим, що у гаплоїдів відсутнє явище домінування (генотип ві дповідає фенотипу), то їх можна широко використовувати в мутаційній селекції.

29

Робота 14, Ріст і розвиток пиляків в культурі in vitro (андрогенез)

Культивування in vitro пиляків дає можливість отримувати гаплоїдні рослини та гаплоїдні калюсні тканини. Це явище отримало назву андрогенез і представляє великий інтерес для селекції та генетики, так як у гаплоїдів набагато легше виявити і відібрати цінні мутації; а з допомогою колхіцину з них можна отримати диплоїдні рослини. Пиляки, які запрограмовані не на утворення гамет, в умовах культури in vitro переключаються на процеси властиві вегетативній клітині. На ранніх стадіях розвитку пиляку в ньому закладаються багатоклітинні пилкові гнізда (мікроспорангії), з яких шляхом редукційного поділу утворюються тетради гаплоїдних мікроспор. Далі мікроспори діляться мітотично і формуються зрілі пилкові зерна (пилинки), які зовні оточені екзиною і інтиною, а всередині містять ядро пилкової трубки і два спермії.

Мітотичний поділ мікроспор з наступною диференціацією вмісту на дві клітини (велику вегетативну і маленьку генеративну) і є початком проростання мікроспори.

Існує два методи одержання гаплоїдів шляхом андрогенезу in

vitro:

1 - метод культури пиляків (пилок знаходиться всередині соматичних тканин пиляку)

2 - метод культури пилку (мікроспор), при якому всі соматичні клітини відокремлюються.

Пиляки виділяють із бутонів і переносять на поживне середовище, при цьому велике значення мають вік і умови вирощування донорських рослин, з яких одержують пиляки (температура, фотоперіод та інтенсивність освітлення). Світлові умови впливають на процеси індукції новоутворень в культурі пиляків і пилку.

Мета роботи: набуття навичок по виділенню пиляків та спостереження за їх розвитком в умовах in vitro.

Матеріали і обладнання: рослини ріпаку на стадії цвітіння, стерилізуючі розчини (70% етанол, розчин діоциду), стерильна дистильована вода, стерильні пінцети, ланцети, поживні середовища для андрогенезу, мікроскоп, 3% розчин ацетокарміну, предметні та покрівельні скельця, ламінар-бокс.

ХІД РОБОТИ:

1.Зрізані квітки ріпаку витримують протягом 4 діб при температурі +4°С в холодильній камері.

2.Зафарбовують мікроспори 3% розчином ацетокарміну і визначають під мікроскопом стадію розчитку пилку в пиляку. Відби-

30

рають бутони з пиляками, які містять переважно одноядерні мікроспори, враховуючи те, що оптимальною для андрогенезу є стадія ранньої одноядерної мікроспори.

3.Відділяють квіткові бруньки і стерилізують їх в розчині діоциду з наступним трьохразовим промиванням в стерильній воді.

4.За допомогою пінцету відбирають пиляки і висаджують їх у флакончики на поживне середовище, склад якого:

рН 5,5-5, б до автоклавування

5.Інкубують пиляки при температурі +24 - 27°С, інтенсивності освітлення 2000 лк та фотоперіоді 14 годин.

6.Через 25 - ЗО днів проводять візуальне визначення частоти утворення калюсу та морфологічних структур на експлантах. Результати записують у таблицю 6.

Робота 15, Одержання гаплоїдів з жіночого гаметофіту (гіногенез)

Практикам відомі деякі способи одержання гаплоїдних рослин з жіночого гаметофіту.

1. Затримка у запиленні, яка призводить до поділу яйцеклітини без запліднення.

2. Запліднення пилком іншого виду рослин або пилком, ядра якого вбиті великими дозами опромінення.

31