- •1. Определение антимикробного действия лекарственного средства
- •1.2. Работа с тест-микроорганизмами
- •1.3. Проведение испытания
- •1.4. Учет и интерпретация результатов
- •1.5. Способы устранения антимикробного действия лекарственных средств
- •2. Особенности отбора и подготовки образцов для анализа
- •2.1. Твердые лекарственные формы
- •2.2. Мягкие лекарственные формы
- •2.3. Жидкие лекарственные формы
- •2.4. Аэрозоли
- •2.5. Трансдермальные пластыри
- •2.6. Лекарственные растительные средства
- •3. Методы количественного определения аэробных бактерий и грибов
- •3.2. Количественное определение микроорганизмов
- •3.2.2. Метод мембранной фильтрации
- •3.2.3. Метод наиболее вероятных чисел (нвч)
- •4. Определение отдельных видов бактерий
- •4.1. Энтеробактерии и подобные им грамотрицательные микроорганизмы
- •4.2. Выявление Escherichia coli
- •4.3. Выявление бактерий рода Salmonella
- •4.4. Выявление Pseudomonas aeruginosa
- •4.5. Выявление Staphylococcus aureus
- •5. Биохимические тесты для идентификации микроорганизмов
- •5.1. Тест на наличие цитохромоксидазы
- •5.2. Тест на наличие индола
- •5.3. Тест на наличие коагулазы (реакция плазмокоагуляции)
- •6. Питательные среды. Определение ростовых и селективных свойств
- •6.1. Рекомендуемые растворы и питательные среды
- •6.2. Ростовые и селективные свойства питательных сред
5. Биохимические тесты для идентификации микроорганизмов
5.1. Тест на наличие цитохромоксидазы
Реактив: 1% раствор N,N-диметил-пара-фенилендиамина дигидрохлорида. Раствор хранят при температуре от 4 до 10 ºС во флаконах нейтрального све-
тозащитного стекла. Раствор должен быть бесцветным.
Полоску фильтровальной бумаги смачивают реактивом. Платиновой петлей или стеклянной палочкой наносят 24-часовую чистую культуру исследуемых бактерий, выросших на соево-казеиновом агаре или среде № 1. Темно-красное окрашивание, появляющееся в течение 1 мин, свидетельствует о положительной оксидазной реакции. Положительным контролем служит культура P.aeruginosa, отрицательным – культура E.coli.
5.2. Тест на наличие индола
Реактив Ковача:
Спирта амилового (П9) или изоамилового (И5) – 75 мл Пара-диметиламинобензальдегида (Д38) – 5 г Хлористоводородной кислоты конц. (Х21) – 20 мл
Навеску альдегида растворяют в спирте при легком нагревании (на водяной
бане при 50-55 ºС), остужают и медленно добавляют кислоту. Раствор хранят в защищенном от света месте при температуре от 4 до 10 ºС. Реактив должен быть желтого цвета. При неправильном хранении цвет реактива становится коричневым, и реактив непригоден для использования.
В пробирку с соево-казеиновым бульоном или со средой № 15, в которой выросла исследуемая культура, вносят 0,5 мл реактива Ковача и слегка встряхивают. Через несколько минут при наличии индола наблюдают появление красного кольца на поверхности среды в пробирке. Положительным контролем является культура E.coli, отрицательным – культура S.abony.
5.3. Тест на наличие коагулазы (реакция плазмокоагуляции)
Сухую цитратную кроличью плазму разводят согласно приложенной инструкции 0,9 % стерильным раствором натрия хлорида изотоническим и разливают по 0,5 мл в стерильные пробирки. В пробирку помещают 1 петлю суточной культуры выделенных кокков, выращенных на соево-казеиновом агаре или на среде № 1. Положительным контролем служит культура S.aureus, отрицательным – культура S.epidermidis. Необходимо поставить также контроль неконтаминированной плазмы. Пробирки инкубируют при температуре (32,5 ± 2,5) ºС. Реакцию плазмокоагуляции отмечают через каждый час в течение 4-6 ч, слегка наклоняя пробирку, но, не встряхивая ее.
При отсутствии положительной реакции плазмокоагуляции удлиняют время инкубации до 24 ч для получения окончательных результатов.
Тест на наличие коагулазы считается положительным при коагуляции плазмы.
6. Питательные среды. Определение ростовых и селективных свойств
Для испытания лекарственных средств на стерильность и микробиологическую чистоту используют питательные среды отечественного или зарубежного производства.
Готовить питательные среды следует, строго придерживаясь приведенной рецептуры, а сухие питательные среды – согласно инструкции по применению предприятия-изготовителя. Необходимый рН питательных сред устанавливают при температуре (25 ± 2) ºС. Среды стерилизуют в автоклаве в течение 15 мин при температуре 121 ºС, если нет других указаний, при условии валидации процесса стерилизации.
Определение ростовых и селективных свойств проводят для каждой серии коммерческой среды (сухой и готовой к использованию), а также для каждой партии среды, изготовленной в лаборатории.
Питательные среды должны обеспечивать рост и развитие микроорганизмов- контаминантов лекарственных средств.