^{32. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ ЧИСТОТА (ОФС 42-0067-07)}

Нестерильные лекарственные средства (субстанции, различные формы препаратов – таблетки, капсулы, гранулы, растворы, суспензии, сиропы, мази, суппозитории и др., а также вспомогательные вещества) могут быть контаминированы микроорганизмами. В них допускается наличие лимитированного количества микроорганизмов, при отсутствии определенных видов бактерий, представляющих опасность для здоровья человека.

Приведенные ниже методы определения микробиологической чистоты распространяются на нестерильные лекарственные средства (субстанции и препараты), вспомогательные вещества и полупродукты, а также используются при определении эффективности антимикробных консервантов и мониторинге производственных помещений фармацевтических предприятий и лабораторий контрольных служб.

В табл. 32.1 и 32.2 приведены требования к лекарственным средствам (лекарственным препаратам и субстанциям), а также вспомогательным веществам, используемым в производстве лекарственных препаратов.

Таблица 32.

Категория	Препараты	Рекомендуемые требования
1	2	3
1	Препараты, к которым предъявля- ется требование «стерильность»	Препараты должны быть стерильными
2	● Для применения местно, на- ружно, интравагинально ● Для введения в полости уха, носа ● Респираторно ● Трансдермальные пластыри За исключением тех лекарствен- ных препаратов, которые должны быть стерильными	● Общее число аэробных бактерий и грибов (суммарно) не более 102 в 1 г или в 1 мл, или на 1 пластырь (включая клейкую сторону и основу) ● Отсутствие энтеробактерий и других грамотрицательных бак- терий на 1 пластырь (включая клейкую сторону и основу) ● Не более 101 энтеробактерий и других грамотрицательных бак- терий в 1 г или в 1 мл остальных препаратов ● Отсутствие Pseudomonas aerugi- nosa в 1 г или в 1 мл, или на 1 пластырь (включая клейкую сторону и основу) ● Отсутствие Staphylococcus au- reus в 1 г или в 1 мл, или на 1 пластырь (включая клейкую сторону и основу)

Микробиологическая чистота лекарственных препаратов 1

1	2	3
3	А. Для приема внутрь или введения ректально Б. Для приема внутрь – из сырья природного происхождения (живот- ного, растительного или минераль- ного), уровень микробной загрязненности которого невоз- можно снизить в процессе предва- рительной обработки и относительно которого федераль- ный орган контроля качества ле- карственных средств допускает уровень микробной загрязненности более 103 жизнеспособных микро- организмов в 1 г или в 1 мл. Исключением являются лекарст- венные растительные средства, включенные в Категорию 4	● Общее число аэробных бактерий не более 103 в 1 г или в 1 мл ● Общее число грибов не более 102 в 1 г или в 1 мл ● Отсутствие Escherichia coli в 1 г или в 1 мл ● Общее число аэробных бактерий не более 104 в 1 г или в 1 мл ● Общее число грибов не более 102 в 1 г или в 1 мл ● Энтеробактерий и других грам- отрицательных бактерий не более 102 в 1 г или в 1 мл ● Отсутствие Escherichia coli в 1 г или в 1 мл ● Отсутствие Salmonella в 10 г или в 10 мл ● Отсутствие Staphylococcus au- reus в 1 г или в1 мл
4	Лекарственные растительные сред- ства, состоящие из одного вида сырья (фасованная продукция) или нескольких (сборы), а также расти- тельное сырье «ангро» А. Лекарственные растительные средства или лекарственное сырье «ангро», применяемые в виде на- стоев и отваров, приготовленные с использованием кипящей воды Б. Лекарственные растительные средства или растительное сырье «ангро», приготовленные без ис- пользования кипящей воды	● Общее число аэробных бактерий не более 107 в 1 г ● Общее число грибов не более 105 в 1г ● Escherichia coli не более 102 в 1 г ● Общее число аэробных бактерий не более 105 в 1 г ● Общее число грибов не более 104 в 1 г ● Энтеробактерий и других грам- отрицательных бактерий не более 103 в 1 г ● Отсутствие Escherichia coli в 1 г ● Отсутствие Salmonella в 10 г

Таблица 32.2

Микробиологическая чистота субстанций и вспомогательных веществ для производства лекарственных препаратов

Катего- рия	Субстанции, вспомогательные вещества	Рекомендуемые нормы
1	2	3
1.2	Субстанции для производства: А. Стерильных лекарственных пре- паратов, которые не подвер- гаются стерилизации Б. Стерильных лекарственных пре- паратов, которые подвергаются стерилизации В. Нестерильных лекарственных препаратов, относящихся к Кате- гории 2	Субстанции должны быть сте- рильными ● Общее число аэробных бактерий и грибов (суммарно) не более 102 в 1 г или в 1 мл ● Отсутствие энтеробактерий в 1 г или в 1 мл ● Отсутствие Pseudomonas aerugi- nosa в 1 г или в 1 мл ● Отсутствие Staphylococcus au- reus в 1 г или в 1 мл
2.2	Субстанции синтетического происхождения для производства нестерильных лекарственных пре- паратов	● Общее число аэробных бактерий не более 103 в 1 г или в 1 мл ● Общее число грибов не более 102 в 1 г или в 1 мл ● Отсутствие Escherichia coli в 1 г или в 1 мл
3.2	Субстанции природного происхож- дения (растительного, животного или минерального) для производ- ства нестерильных лекарственных препаратов	● Общее число аэробных бактерий не более 104 в 1 г или в 1 мл ● Общее число грибов не более 102 в 1 г или в 1 мл ● Отсутствие Escherichia coli в 1 г или в 1 мл ● Отсутствие Salmonella в 10 г или в 10 мл ● Отсутствие Pseudomonas aerugi- nosa в 1 г или в 1 мл ● Отсутствие Staphylococcus au- reus в 1 г или в 1 мл ● Энтеробактерий не более 102 в 1 г или в 1 мл
4.2	Вспомогательные вещества (мука пшеничная, крахмал, тальк и т.д.)	● Общее число аэробных бактерий не более 103 в 1 г или в 1 мл ● Общее число грибов не более 102 в 1 г или в 1 мл ● Отсутствие Escherichia coli в 1 г или в 1 мл ● Отсутствие Salmonella в 10 г или в 10 мл ● Отсутствие Pseudomonas aerugi- nosa в 1 г или в 1 мл ● Отсутствие Staphylococcus au- reus в 1 г или в 1 мл ● Других энтеробактерий- не более 102 в 1 г или в 1 мл

Примечания к табл. 32.1 и 32.2

1. В нормативных документах могут быть указаны в виде исключения и другие нормы в зависимости от состава препарата и особенностей технологического процесса производства.

2. В нормативных документах на препараты для детей должны быть введены более жесткие нормы, а именно: количество аэробных бактерий в 1 г или в 1 мл – в пределах от 100 до 500, количество грибов – от 10 до 50, отсутствие бактерий семейства Enterobacteriaceae, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus.

3. При обнаружении во время проведения испытания других патогенных бактерий, кроме указанных выше, считают, что качество лекарственных средств, субстанций и вспомогательных веществ не соответствует требованиям по пока^{зателю «микробиологическая чистота».}

Испытание на микробиологическую чистоту включает способы подготовки образцов различных лекарственных форм перед испытанием, отбор образцов для анализа, методы количественного определения жизнеспособных бактерий и грибов, выявление и идентификацию отдельных видов бактерий, наличие которых недопустимо или ограничено в нестерильных лекарственных средствах, а также питательные среды, растворы и реактивы.

Испытание проводят в асептических условиях, чтобы предотвратить контаминацию исследуемых образцов.

1. Определение антимикробного действия лекарственного средства

Перед проведением контроля необходимо определить, обладает ли исследуемое лекарственное средство в условиях испытания на микробиологическую чистоту антимикробным действием, подавляющим рост отдельных видов бактерий и грибов, так как это может привести к неправильной оценке результатов анализа.

Для определения антимикробного действия используют тест-микроорганизмы, представленные в табл. 32.3.

Таблица 32.3

Тест-микроорганизмы для определения антимикробного действия

Тест-штаммы	Источник получения
Bacillus subtilis ATCC 6633 Bacillus cereus АТСС 10702 Escherichia coli ATCC 25922 Salmonella abony IHE 103/39 Pseudomonas aeruginosa ATСС 9027 (или P. aeruginosa ГИСК 453) Staphylococcus aureus ATCC 6538-Р	Государственная коллекция патогенных микроорганизмов ГИСК им. Л.А. Тарасевича, Россия, г. Москва
Candida albicans NCTC 885-653 Candida albicans АТСС 10231	Всероссийский микологический Центр, Россия, г. Санкт-Петербург
Aspergillus niger АТСС 9642	Всероссийская коллекция микроорганизмов РАН, Россия, г. Москва

Кроме вышеперечисленных тест-штаммов можно использовать и другие микроорганизмы из различных коллекций, типичные по культурально-морфологическим, тинкториальным и биохимическим свойствам. Набор тест-микроорганизмов может быть уменьшен или увеличен в зависимости от способа применения или состава испытуемого лекарственного средства.

1.2. Работа с тест-микроорганизмами

Ампулы с лиофилизированными культурами бактерий и грибов вскрывают в асептических условиях и вносят в них около 0,5 мл соответствующей жидкой питательной среды (например, среда № 8 – для бактерий, жидкая среда Сабуро – для C.аlbicans). Полученную взвесь тест-культур переносят в пробирки с теми же жидкими питательными средами и инкубируют при соответствующей температуре в течение 24 ч (бактерии) или 48 ч (C.albicans). После 2-3-х пассажей с бульона на бульон культуру микроорганизмов пересевают с помощью бактериологической петли на питательный агар в чашках Петри для получения изолированных колоний. Выросшую культуру каждого тест-штамма проверяют визуально на чистоту роста, изучают культурально-морфологические, тинкториальные и биохимические свойства. Типичные колонии пересевают в пробирки на скошенный агар того же состава и инкубируют, как было указано выше, считая полученную культуру исходной.

Культуру A.niger пересевают на агар Сабуро и инкубируют при температуре (22,5 ± 2,5) ºС в течение 5-7 сут до появления конидий (экзогенных спор черного или темно-коричневого цвета).

Культуры бактерий пересевают каждый месяц, грибов – каждые 3 месяца, делая не более 5 пассажей с агара на агар, после чего используют новую ампулу или исходную культуру со среды хранения.

Тест-штаммы бактерий хранят при температуре (5 ± 1) ºС в лиофилизированном состоянии или под слоем стерильного вазелинового масла на среде Романова.

Тест-культуру С.albicans хранят под слоем стерильного вазелинового масла на среде № 2 (агар Сабуро), в которой количество агара уменьшено до 0,5 %. Тест-культуру A.niger хранят на среде № 2.

При пересеве культур со сред хранения предварительно удаляют слой масла над агаром, бактериологической петлей снимают верхний слой агара с выросшей культурой и переносят его в пробирки со средой № 8 для бактерий, жидкой средой Сабуро – для C.аlbicans. Посевы на среде № 8 инкубируют при температуре (32,5 ± 2,5) ºС в течение 18-24 ч, посевы на жидкой среде Сабуро – при температуре (22,5 ± 2,5) ºС в течение 48 ч для C.аlbicans. Для получения конидий культуру A.niger пересевают на среду № 2 и инкубируют при температуре (22,5 ± 2,5) ºС в течение 5-7 сут.

1.2.1. Приготовление спор B.subtilis

Если не удается получить гомогенную взвесь клеток B.subtilis, используют споры, получаемые следующим образом.

Культуру B.subtilis выращивают в пробирке на скошенном соево-казеиновом агаре или среде № 1 в течение 24 ч при температуре (32,5 ± 2,5) ºС. Смывают

5 мл стерильного 0,9 % изотонического раствора натрия хлорида со стерильными стеклянными бусами. Взвесь бактерий переносят в матрац с 300 мл скошенного питательного агара, содержащего для ускорения спорообразования марганца сульфат в количестве 1 мг/л среды. Посевы инкубируют в течение

7 сут. при температуре (32,5 ± 2,5) ºС. Для подтверждения достаточного образования спор выросшую культуру микроскопируют. Если в мазках, окрашенных ^{по Граму, имеется в поле зрения 80-90 % спор, делают смыв культуры, внося в} матрац 45 мл стерильного 0,9 % изотонического раствора натрия хлорида. Нагревают полученную взвесь 30 мин на водяной бане при температуре 65 ºС, центрифугируют при 4300 об/мин в течение 15 мин, отмывают не менее 3 раз стерильным 0,9 % изотоническим раствором натрия хлорида до полной прозрачности надосадочной жидкости. Снова нагревают на бане при температуре 65 ºС в течение 30 мин. Центрифугируют в течение 15 мин, ресуспендируют осадок (споры) в том же растворе, определяют количество спор в 1 мл чашечным агаровым методом. Хранят суспензию спор при (5 ± 1) ºС в запаянных ампулах или пробирках не менее 8 недель.