6. Иммунофлюоресцентный анализ.

Иммунофлюоресценция — люминесценция (свечение) при микроскопии в ультрафиолетовом спектре биологического объекта, предварительно обработанного меченными флюорохромом антителами. Иммунофлюоресценция разработана Кунсом в 1942 г. и применяется как метод экспресс-диагностики инфекционных болезней.

Принцип иммунофлюоресцентного метода (реакции иммунофлюоресценции – РИФ) основан на визуальном учете специфического взаимодействия флюорисцирующих специфических антител с гомологичным антигеном. Образующийся при этом, комплекс антиген-антитело, меченный флюорохромом, легко обнаружить по характерному свечению в сине-фиолетовых лучах люминесцентного микроскопа (приложение 2). Таким образом, с помощью РИФ реализуется непосредственный контроль за первой фазой серологических реакций, причем специфичность метода сочетается с высокой чувствительностью. Предложено и применяется несколько вариантов реакции иммунофлюоресценции:

A. Прямая реакция иммунофлюоресценции (РИФ) – для её выполнения используют непосредственно специфические антитела, меченные флюорохромом.

B. Непрямая реакция иммунофлюоресценции (РНИФ) – для её выполнения используют видоспецифические (против антител человека или животных) иммуноглобулины, меченные флюорохромом.

Постановка РИФ: на обезжиренном предметном стекле из исследуемого материала делают тонкие мазки, а из органов и тканей – мазки-отпечатки. Препараты подсушивают на воздухе, фиксируют (химические фиксаторы, лучше ацетон), наносят на них люминесцирующую сыворотку, взятую в рабочем разведении, и помещают во влажную камеру (эксикатор с водой) при температуре 37⁰С на 20-30 минут (на 25-40 минут при температуре 18-21⁰С). Затем для удаления избытка флюоресцирующих антител препарат промывают в забуференном изотоническом растворе натрия хлорида в течение 10-15 минут с последующим ополаскиванием в дистиллированной воде в течение 10 минут. Сушат при комнатной температуре и исследуют в люминесцентном микроскопе или в обычном микроскопе с люминесцентной приставкой, с использованием масляной иммерсионной системы.

Для оценки интенсивности специфической флюоресценции бактериальных клеток используется четырехплюсовая шкала: «+++» и «+++» – очень яркая и яркая; «++» и «+» – выраженная и слабая ободочная, зеленая флюоресценция клеток.

Постановка РНИФ: на обезжиренном предметном стекле из исследуемого материала делают тонкие мазки, а из органов и тканей – мазки-отпечатки. Препараты подсушивают на воздухе, фиксируют (химические фиксаторы, лучше ацетон), наносят на них иммунную специфическую сыворотку, взятую в рабочем разведении, и помещают во влажную камеру (эксикатор с водой) при температуре 37⁰С на 20-30 минут (на 25-40 минут при температуре 18-21⁰С). Для удаления избытка специфических антител препарат промывают в забуференном изотоническом растворе натрия хлорида в течение 10-15 минут с последующим ополаскиванием в дистиллированной воде в течение 10 минут. Затем наносят на них антитела к иммуноглобулинам животного, при иммунизации которого была полученная использованная на первом этапе иммунная специфическая сыворотка, меченные флюорохромом, взятые в рабочем разведении, и помещают во влажную камеру (эксикатор с водой) при температуре 37⁰С на 20-30 минут (на 25-40 минут при температуре 18-21⁰С). Затем для удаления избытка флюоресцирующих антител препарат промывают в забуференном изотоническом растворе натрия хлорида в течение 10-15 минут с последующим ополаскиванием в дистиллированной воде в течение 10 минут. Сушат при комнатной температуре и исследуют в люминесцентном микроскопе или в обычном микроскопе с люминесцентной приставкой, с использованием масляной иммерсионной системы (например, МИКМЕД 2вар.11).

Для оценки интенсивности специфической флюоресценции бактериальных клеток используется четырех плюсовая шкала: «+++» и «+++» – очень яркая и яркая; «++» и «+» – выраженная и слабая ободочная, зеленая флюоресценция клеток.

Примеры реагентов: линия MONOFLUOKIT “Sanofi Pasteur” (Франция), выявление антигена - индикация возбудителей: аденовирусов, циомегаловируса, криптоспоридий, вирусов гриппа и вирусов парагриппа, ВИЧ 1 - 2, герпесвирусов 1 - 2, вирусов бешенства, респираторно-синцитиального вируса, легионелл, хламидий, микоплазм, уреаплазм, трепонем, риккетсий, плазмодий малярии, пневмоцист и токсоплазм. Отечественные реагенты РИФ для определения иерсиний чумы, псевдотуберкулеза, бруцелл, вирусов полиомиелита, вирусов гепатита А,Е,В,С,D, вирусов клещевого энцефалита , лихорадки денге и крымской геморрагической лихорадки, вируса бешенства. Диагностические наборы «С.Т.Д.-тест», для определения возбудителей инфекций, передаваемых половым путем: С.Т.Д.-тест- уреаплазма, С.Т.Д.-тест- микоплазма, С.Т.Д.-тест хламидия.

Серологические реакции с использованием специфических антител меченных флюорохромами прочно вошли в практику экспресс - диагностики вирусных и бактериальных инфекций, широко используются в идентификации микроорганизмов. Время исследования 1,5-2 часа.