Проведение анализа

Добавить в кювету	Опытная проба	Холостая проба	Стандартная проба
1. Сыворотка	10 мкл	--	--
2. Стандарт	--	--	10 мкл
3. Дистиллиро-ванная вода	--	10 мкл	--
4. Реагент	1 мл	1 мл	1 мл

Перемешать содержимое каждой пробирки. Инкубировать 10 мин при температуре 37С. Измерить оптическую плотность опытной и стандартной проб против холостой пробы при длине волны 550 нм (А). Окраска стабильна в течение 30 минут.

Расчет

Расчет по стандарту концентрации холестерола в сыворотке проводят по формуле:

Аоп С (ммоль/л) = -----------  Сст, Аст

где А_{оп / ст} – оптическая плотность опытной пробы и стандартной,

соответственно;

С_ст – концентрация стандарта (ммоль/л).

Если концентрация холестерола превышает 19,4 ммоль/л (точка вне зоны линейности калибровочного графика), анализируемый образец (сыворотка или моча) следует развести 1:1 физиологическим раствором и повторить измерение, а полученный результат расчета умножить на 2.

Клинико-диагностическое значение: Уровни холестерола важны в диагностике и классификации гиперлипопротеинемий.

Концентрация холестерина в сыворотке указывает на работу печени, билиарного тракта, всасывание в кишечнике.

Высокие концентрации холестерина говорят об угрозе ишемической болезни сердца, о нарушении тиреоидной функции и заболеваниях надпочечников.

Лабораторная работа № 10.

Определение концентрации холестерина ЛПВП в сыворотке крови

Принцип метода: Холестерол липопротеинов высокой плотности (ЛПВП) определяют после осаждения из сыворотки липопротеинов низкой и очень низкой плотности (ЛПНП и ЛПОНП, соответственно). Супернатант содержит холестерол, связанный с ЛПВП в растворенной форме и определяется ферментативным методом для определения концентрации общего холестерола.

Интенсивность окраски раствора при длине волны 550 нм прямо пропорциональна концентрации холестерола в ЛПВП.

Линейность метода: до 19,4 ммоль/л.

Норма:

Сыворотка крови –  0,9 ммоль/л (37С).

Оборудование и реагенты:

1. Спектрофотометр с термостатированной кюветой, длина волны 550 нм, длина оптического пути 1 см; температура реакции 37С;

2. Секундомер;

3. Автоматические пипетки на 10 мкл, 400 мкл , 2 мл и 1000 мкл;

4. Сыворотка крови;

5. Осаждающий реагент (хлорид магния, 100 ммоль/л в ортофосфорной кислоте, 30,3 ммоль/л)

6. Реагент (холестеролэстераза, холестеролоксидаза  50 Е/л, пероксидаза  1000 Е/л, 4-аминоантипирин 0,3 ммоль/л);

7. Стандарт (Холестерол 1,2 ммоль/л);

8. Дистиллированная вода.

Проведение анализа

В пластиковую пробирку внести 400 мкл сыворотки и добавить 2 мл осаждающего реагента. Тщательно перемешать в течение 15 секунд. После чего центрифугировать 3000 об/мин в течение 5 минут. Отобрать 1мл супернатанта в чистую пробирку и использовать для последующего определения холестерола в ЛПВП.

Добавить в кювету	Опытная проба	Холостая проба	Стандартная проба
1. Супернатант	10 мкл	--	--
2. Стандарт	--	--	10 мкл
3. Дистиллиро-ванная вода	--	10 мкл	--
4. Реагент	1 мл	1 мл	1 мл

Перемешать содержимое каждой пробирки. Инкубировать 10 мин при температуре 37С. Измерить оптическую плотность опытной и стандартной проб против холостой пробы при длине волны 550 нм (А). Окраска стабильна в течение 30 минут.

Расчет

Расчет по стандарту концентрации холестерола в сыворотке проводят по формуле:

Аоп С (ммоль/л) = -----------  Сст, Аст

где А_{оп / ст} – оптическая плотность опытной пробы и стандартной,

соответственно;

С_ст – концентрация стандарта (ммоль/л).

Общий холестерол сыворотки
Норма	Пограничные значения	Высокий уровень
 5,2 ммоль/л	5,2-6,1 ммоль/л	 6,2 ммоль/л
Холестерол ЛПВП
Норма	Пограничные значения	Низкий уровень
 0,9 ммоль/л	 0,9 ммоль/л;  0,9 ммоль/л	 0,9 ммоль/л

Клинико-диагностическое значение: Содержание холестерола в ЛПВП в кови здоровых людей мало меняется с возрастом и не подвержено колебаниям.

Величины содержания холестерола в ЛПВП  0,9 ммоль/л свидетельствуют о нарушении липидного обмена и угрозе атеросклероза. Повышение содержания холестерола в ЛПВП, как и повышение содержания общего холестерина в результате увеличения этой фракции, является доброкачественным состоянием.