Проведение анализа

Добавить в кювету	Опытная проба	Холостая проба	Стандартная проба
1. Сыворотка	5 мкл	--	--
2. Стандарт	--	--	5 мкл
3. Дистиллиро-ванная вода	--	5 мкл	--
4. Рабочий реагент	1 мл	1 мл	1 мл

Перемешать тщательно в течение 15 секунд содержимое пробирок, избегая образования пены. Инкубировать при комнатной температуре 10 минут. Измерить оптическую плотность опытной и стандартной проб против холостой пробы при длине волны 630 (590-640) нм. Окраска стабильна в течение 8 часов.

Расчет

Расчет по стандарту концентрации альбумина в сыворотке (плазме) проводят по формуле:

Аоп С (г/л) = -----------  Сст, Аст

где А_оп и А_ст – оптическая плотность опытной и стандартной проб,

соответственно;

С_ст – концентрация стандарта.

Если концентрация альбумина превышает 60 г/л (точка вне зоны линейности калибровочного графика), анализируемый образец (сыворотка или плазма) следует развести 1:1 физиологическим раствором и повторить измерение, а полученный результат расчета умножить на 2.

Клинико-диагностическое значение: Гиперальбуминемия наблюдается при тех же состояниях, что и гиперпротеинемия.

Гипоальбуминемия наступает при больших потерях белка, связанных с кровотечением, нарушением синтеза белка в печени и усилением процессов его распада.

Лабораторная работа № 18.

Определение концентрации С-реактивного белка в сыворотке крови иммунотурбидиметрическим методом

Принцип метода: С-реактивный белок (СРБ) сыворотки взаимодействует с моноспецифическими антителами, присутствующими в избытке в реакционной смеси с образованием преципитата, усиленного ПЭГ.

Турбидиметрическое определение концентрации СРБ основано на регистрации оптической плотности анализируемой пробы при длине волны 340 нм.

Диапазон измерения метода: 8-150 мг/л.

Норма: до 10 мг/л (37С);

СРБ в сыворотке сохраняет стабильность при замораживании (-20С) в течение 6 месяцев.

Оборудование и реагенты:

1. Спектрофотометр с термостатированной кюветой, длина волны 340 нм, длина оптического пути 1 см; температура реакции 37С;

2. Секундомер;

3. Автоматические пипетки на 75 мкл, 200 мкл и 1000 мкл;

4. Сыворотка крови негемолизированная / плазма;

5. СРБ-буфер (ТРИС-буфер 0,01 моль/л, содержащий 5% ПЭГ);

6. Антисыворотка против СРБ;

7. Калибровочные растворы №№ 1-5 с указанной на этикетках концентрацией СРБ;

8. Физиологический раствор (хлорид натрия 0,9%).

Антисыворотка разводится в 3 раза (1:2) СРБ буфером с ПЭГ (полиэтиленгликолем). Разведенная антисыворотка годна для применения при условии хранения его при температуре 2-8С в течение 30 дней.

Проведение анализа

Перед проведением анализа реагенты следует прогреть до температуры измерения (37С).

Добавить в кювету	Холостая проба	Опытная проба	Стандартная проба
1. Стандарт	--	--	75 мкл
2. Сыворотка	--	75 мкл	--
3. Буфер для СРБ	1 мл	1 мл	1 мл
Перемешать в течение 15 с. Инкубировать 10 минут при температуре 37С. Измерить оптическую плотность холостой пробы.
4. Антисыворотка против СРБ	--	200 мкл	200 мкл

Перемешивать содержимое пробирок в течение 15 секунд. Измерить оптическую плотность проб при длине 340 нм ровно через 5 минут после добавления антисыворотки.

Расчет

Расчет концентрации СРБ проводят по нелинейной калибровочной кривой:

№ стандар-та	Оптическая плотность при 340 нм	№ стандар-та	Оптическая плотность при 340 нм
Стандарт 1		Стандарт 4
Стандарт 2		Стандарт 5
Стандарт 3

Если концентрация СРБ пробы выше самой высокой концентрации стандартного раствора СРБ (точка вне рабочей зоны калибровочного графика), анализируемую сыворотку следует развести 1:4 физиологическим раствором и повторить измерение, а полученный результат умножить на 5.

Клинико-диагностическое значение: СРБ – это ₂-глобулин и компонент неспецифического иммунного ответа на ранних стадиях проникновения антигена в организм. СРБ способствует удалению из крови эндогенных веществ, образующихся в результате разрушения клеток организма (полисахариды, гликопротеины, нуклеиновые кислоты, фосфатидилхолин и пр.).

СРБ относится к белкам острой фазы. При тяжелых воспалениях синтез его в печени возрастает более, чем в тысячу раз. Уровень СРБ в крови увеличивается в течение 6-10 часов в реакциях острой фазы (разрушение тканей, воспаление).

Концентрация СРБ у курильщиков может достигать 25 мг/л. После хирургического вмешательства (если нет осложнений) СРБ держится в течение 2 дней на уровне до 150 мг/л, а затем возвращается в норму.

Плохим прогностическим признаком является СРБ  200 мг/л на протяжении 10 дней и более после хирургического вмешательства. За 1-2 дня до летального исхода СРБ заметно увеличивается.

Определение концентрации СРБ используют для отличия бактериальных инфекций от вирусных. Концентрация СРБ до 50 мг/л обычно наблюдается при легких вирусных инфекциях и местных бактериальных инфекциях; 50-150 мг/л – в основном при бактериальных инфекциях и в отдельных случаях при тяжелых вирусных инфекциях;  150 мг/л – при тяжелых бактериальных инфекциях.

Максимальная концентрация СРБ может доходить до 400 мг/л у новорожденных и примерно до 850 мг/л у взрослых.

Лабораторная работа № 19.

Определение компонентов мочи с помощью диагностических полосок (HUMAN-Test Combina)

Принцип метода: В основе работы тест-полосок лежат методы сухой химии. Полоски предназначены для полуколичественного определения компонентов мочи по результатам цветных и ферментативных реакций в толще полоски.

Интенсивность окраски тестовой области полоски сравнивается с цветовой шкалой для каждого компонента.

Оборудование и реагенты:

1. Тест-полоски;

2. Свежесобранная моча;

3. Цветовые шкалы для показателей на этикетке контейнера для тест-полосок.