Проведение анализа

Добавить в кювету	Опытная проба	Холостая проба	Стандартная проба
1. Образец (например, сыворотка)	25 мкл	--	--
2. Стандарт	--	--	25 мкл
3. Дистиллиро-ванная вода	--	25 мкл	--
4. Реагент 1.	1 мл	1 мл	1 мл
Перемешать содержимое пробирок, инкубировать 5 мин при 37С, или 10 мин при 20-25С. Измерить оптическую плотность А1 против холостой пробы при длине волны 540-560 нм.
5. Реагент 2	250 мкл	250 мкл	250 мкл

Перемешать содержимое каждой пробирки. Инкубировать 10 мин при комнатной температуре или 5 мин при температуре 37С. Измерить оптическую плотность А₂ опытной и стандартной проб против холостой пробы при длине волны 540-560 нм. Вычислить А = А2 – А1 для образца и стандарта.

Расчет

Расчет по стандарту концентрации общего билирубина в сыворотке крови проводят по формуле:

Аоп С (мкмоль/л) = -----------  Сст, Аст

где А – разность оптических плотностей А₁ и А₂;

С_ст – концентрация стандарта (мкмоль/л).

Если концентрация общего билирубина превышает 513 мкмоль/л (точка вне зоны линейности калибровочного графика), анализируемый образец следует развести 1:1 физиологическим раствором и повторить измерение, а полученный результат расчета умножить на 2.

Клинико-диагностическое значение: Билирубин – это продукт распада гемоглобина. Свободный (неконъюгированный) билирубин совершенно неполярен и почти нерастворим в воде, поэтому для транспортирования его в крови от селезенки к печени образуется комплекс с альбумином. В печени билирубин конъюгирует с глюкуроновой кислотой, а образующийся комплекс билирубин–глюкуроновая кислота (связанный билирубин) экскретируется в желчные протоки.

Гипербилирубинемия может бить вызвана увеличенным образованием свободного билирубина в результате гемолиза (гемолитическая/ прегепатитная желтуха), повреждения паренхимы печени (паренхиматозная/ интрагепатитная желтуха) или закупорки желчных протоков (обтурационная/ постгепатитная желтуха).

Хроническая врожденная гипербилирубинемия (преобладание свободного билирубина) называется синдромом Гилберта и встречается довольно часто.

Высокие уровни билирубина наблюдаются у 60-70% новорожденных из-за усиленного послеродового разрушения эритроцитов и отставания в активности ферментов деградации билирубина.

Общепринятые методы анализа определяют либо общий, либо прямой билирубин. Прямой билирубин – это конъюгированный, растворимый в воде билирубин. Следовательно, неконъюгированный (свободный) билирубин может быть оценен как разница между общим и прямым билирубином.

Тема 9. Биохимия крови и мочи

Лабораторная работа № 17.

Определение концентрации альбумина в сыворотке крови по реакции с бромкрезоловым зеленым

Принцип метода: Метод основан на образовании окрашенных комплексных соединений при взаимодействии альбумина с бромкрезоловым знленым в слабокислой среде в присутствии детергента.

Интенсивность окраски пробы при длине волны 630 нм прямо пропорциональна концентрации альбумина в ней.

Линейность метода: 20-60 г/л.

Норма: 35-50 г/л. (18-25С);

Оборудование и реагенты:

1. Спектрофотометр с термостатированной кюветой, длина волны 630 (590-640) нм, длина оптического пути 1 см; температура реакции 18-25С;

2. Секундомер;

3. Автоматические пипетки на 5мкл и 1000 мкл;

4. Сыворотка крови/ плазма негемолизированные;

5. Рабочий реагент (бромкрезоловый зеленый 74 мг, детергент Тритон Х-100 в ацетатном буфере);

6. Стандарт (раствор альбумина 40 г/л);

7. Дистиллированная вода.