Тема 1. Строение и функции белков

Лабораторная работа № 1.

Количественное определение общего белка в сыворотке крови биуретовым методом

Принцип метода: Ионы меди в щелочной среде реагируют с белком с образованием комплекса фиолетового цвета. Оптическая плотность образующегося комплекса прямо пропорциональна содержанию белка в пробе.

Линейность метода:10 – 150 г/л.

Норма:62 – 85 г/л.

Общий белок в негемолизированной сыворотке сохраняет стабильность при комнатной температуре (18-25С) в течение 7 дней, при температуре хранения 2-8С в течение 1 месяца в плотно закупоренном флаконе.

Оборудование и реагенты:

1. Спектрофотометр с термостатированной кюветой, длина волны 540 нм, длина оптического пути 1 см; температура реакции 18-25С;

2. Секундомер;

3. Автоматические пипетки на 20 мкл и 1000 мкл;

4. Сыворотка крови;

5. Физиологический раствор;

6. Реагент (гидроксид натрия – 600 ммоль/л, калий-натрий тартрат – 32 ммоль/л, сульфат меди – 12 ммоль/л, иодид калия – 30 ммоль/л);

7. Калибратор – калибровочный раствор общего белка, 80,0 г/л.

Проведение анализа

Добавить в пробу:	Холостая проба	Калибровочная проба	Опытная проба
1. Калибратор	--	20 мкл	--
2. Сыворотка	--	--	20 мкл
3. Реагент	1 мл	1 мл	1 мл

Перемешать тщательно содержимое пробирок и инкубировать при температуре 25С в течение 10 минут. Измерить оптическую плотность опытной (А_оп) и калибровочной (А_калиб) проб против холостой пробы при длине волны 540 нм.

Окраска раствора стабильна в течение 30 минут.

Гемолиз и липемия влияют на результат, поэтому для таких проб анализ следует выполнять с бланком по пробе ( 20 мкл сыворотки смешивается с 1 мл физраствора). Измеряется оптическая плотность бланка против физраствора и ее значение вычитается из оптической плотности анализируемой пробы.

Расчет

Содержание общего белка в сыворотке рассчитывают по стандарту (калибратор) по формуле:

Аоп С(г/л) = ------------  Скалиб, Акалиб

где С – концентрация общего белка в анализируемой пробе, г/л;

А_оп– оптическая плотность опытной пробы;

А_калиб– оптическая плотность калибровочной пробы;

С_калиб– концентрация общего белка в калибраторе.

При содержании общего белка в пробе свыше 150 г/л (точка вне зоны линейности калибровочного графика), анализируемую сыворотку следует развести 1:1 физиологическим раствором и повторить измерение, а полученный результат расчета умножить на 2.

Клинико-диагностическое значение:Изменения содержания общего белка в сыворотке крови происходят по причине:

1. снижения интенсивности биосинтеза белка в тканях;

2. усиленного распада тканевых белков;

3. нарушения водного баланса;

4. потери белка почками, с кровью.

Гипопротеинемия наблюдается при нефротическом синдроме, синдроме мальабсорбции, заболеваниях кожи (ожог, экзема), массивных кровотечениях, задержке солей и воды (заболевания почек), неправильном питании и голодании. Нарушением синтеза белка, приводящему к снижению его концентрации в сыворотке крови, сопровождаются раковая кахексия, длительные воспалительные процессы.

Гиперпротеинемия наблюдается при состояниях и болезнях, сопровождающихся дегидратацией организма (тяжелые травмы, понос, рвота, сахарный диабет). Она характерна также для хронических воспалительных заболеваний (ревматоидный артрит, диффузные болезни соединительной ткани – коллагенозы, цирроз печени) и острых воспалительных процессов в стадии острой фазы, наблюдается также при макроглобулинемии Вальденстрема.