Занятие № 14. «Белковый обмен»

Цель занятия: изучить методы количественного определения белков; освоить расчетные методы определения биологической ценности белков.

ВОПРОСЫ К КОНТРОЛЬНОЙ РАБОТЕ:

1. Переваривание белков. Протеазы пищеварительного тракта, механизм их активации.

2. Дайте определение понятию «азотистый обмен» и расскажите, как определяется азотистый обмен. Чем вызваны различия в питательной ценности большинства белков растительной природы с одной стороны и животного происхождения с другой?

3. Механизм реакций трансаминирования. Биологическая роль данного процесса.

4. Пути декарбоксилирования аминокислот. Биологическое значение конечных продуктов этих реакций.

5. Дезаминирование аминокислот. Биологическое значение конечных продуктов этих реакций.

6. Роль ароматических аминокислот в метаболизме.

Дата выполнения ________ Балл ____ Подпись преподавателя ____________

Экспериментальная работа.

Опыт 1. Количественное определение общего белка в сыворотке крови.

В плазме крови содержится до 200 различных белковых компонентов. Большая часть выполняемой функции крови, так или иначе, связана с белками плазмы: поддержание онкотического давления, участие в процессах свертывания крови, регуляции рН крови, выполнение транспортной и защитной функции, функции «белкового резерва» и др. Качественное и количественное постоянство белкового состава крови четко поддерживается организмом, и любые изменения в этой системе, как правило, являются отражением нарушенного функционирования тех или органов и тканей.

Приборы. 1. Штатив с пробирками.

2. Набор пипеток.

3. Центрифуга.

4.Центрифужные пробирки.

5. Водяная баня.

6. ФЭК.

7. Кюветы, 10 мм.

Реактивы. 1. Сыворотка крови.

2. Трихлоруксусная кислота, 3%-ный раствор в этаноле.

3. Биуретовый реактив.

4. Хлорид натрия, 0,85%-ный раствор.

а) Определение концентрации альбуминов.

1. В центрифужную пробирку поместите 1,5 мл 3%-ной трихлоруксусной кислоты в этаноле.

2. Добавьте 0,5 мл сыворотки крови, тщательно перемешайте и через 10 мин центрифугируйте.

3. 0,2 мл центрифугата перенесите в пробирку, содержащую 2,3 мл 0,85%-ного раствора хлорида натрия и добавьте 2,5 мл биуретового реактива.

4. Тщательно перемешайте и выдержите 20 мин в термостате при 37С.

5. Измерьте оптическую плотность при зеленом светофильтре (540-560 нм) в кювете с толщиной слоя 10 мм.

б) Определение концентрации общего белка.

1. 0,1 мл сыворотки крови внесите в пробирку, содержащую 2,4 мл 0,85% раствора хлористого натрия.

2. Прибавьте 2,5 мл биуретового реактива.

3. Перемешайте, термостатируйте 30 мин при 37^оС, измерьте оптическую плотность так же, как и при определении альбуминов.

К

Калибровочный график для определения белка биуретовым методом.

онцентрацию альбуминов и общего белка определите по калибровочному графику.

Для определения концентрации альбуминов полученные по стандартному графику значения следует умножить на 2, т.к. в ходе подготовки реакции сыворотка крови была разбавлена в два раза больше, чем при определении общего белка.

Сравните полученные значения с нормальными величинами. О чем свидетельствует снижение (повышение) уровня белка в сыворотке крови у животных? К каким последствия может привести недостаточность альбумина в крови?

Опыт 3. Количественное определение активности аланинаминотрансферазы (АлАТ) в сыворотке крови.

1. В две пробирки внесите реактивы согласно следующей таблице:

	Контрольная проба	Опытная проба
Реагент 1 (АлАТ, субстрат), мл	0,25	0,25
Дистиллированная вода, мл	0,05	–
Сыворотка, мл	–	0,05
Перемешать и инкубировать 30 мин
Реагент 2 (динитрофенилгидразин), мл	0,25	0,25
Перемешать и оставить при комнатной температуре на 20 мин
NaOH (С = 0,4 моль/л), мл	2,5	2,5

2. Перемешайте и через 10 минут измерьте оптическую плотность пробы против контрольной пробы при длине волны 540 нм, кювета с толщиной слоя 5 мм.

3. Активность АлАТ в опытной пробе определите по калибровочному графику в нмоль/сл.

Сравните полученный результат с физиологическими величинами и сделайте вывод. Опишите механизм работы кофермента трансаминаз.

Опыт 2. Белки как противоядие от ионов тяжелых металлов.

Взаимодействие ионов металлов с белками лежит в основе использования молока как противоядия при отравлении тяжелыми металлами.

Приборы. 1. Штатив с пробирками.

2. Набор пипеток.

3. Водяная баня.

Реактивы. 1. Амилаза, раствор.

2. Крахмал, 1%-ный раствор.

3. Ацетат свинца, 1%-ный раствор.

4. Молоко.

5. Дистиллированная вода.

6. Йод, 1%-ный раствор.

1. В опытную пробирку налейте по 1 мл раствора амилазы, 1%-ного раствора крахмала, 1%-ного раствора ацетата свинца (II) и молока.

2. В контрольную пробирку налейте по 1 мл растворов амилазы, крахмала, ацетата свинца (II) и воды.

3. Пробирки встряхните и выдержите 20 минут при температуре 30°С.

4. Добавьте в обе пробирки по 1 капле 1%-ного раствора йода.

Объясните полученные результаты.