1.3 Сучасні уявлення про механізми регуляції шлункової секреції

Важливе місце в діяльності травної системи належить шлунку. Наявність у шлунковому соці соляної кислоти і кислих протеаз визначають унікальне місце шлунка в процесах денатурації, набухання та подальшого розщеплення білків. Відомо, що протеїни їжі засвоюються після гідролізу їх у шлунково – кишковому тракті, в результаті чого вони втрачають видову і тканинну специфічність і набувають здатності всмоктуватись у кров через стінку кишки. Шлункове травлення розглядається як процес початкового гідролізу харчових білків у кислому середовищі, що забезпечується протеолітичними ферментами.

В літературі є достатня кількість нових даних про нервову і гуморальну регуляції секреції шлункових залоз [41]. У вітчизняних і зарубіжних роботах висвітлені питання участі центральних і периферичних структур нервової системи в регуляції секреторної діяльності шлункових залоз [42], показана роль гастроінтестинальних пептидів [43], Са²⁺-чутливих рецепторів [44], циклічних нуклеотидів, оксиду азоту [45] в механізмах регуляції секреторного процесу.

Важливе місце серед факторів, здатних стимулювати секрецію кислого шлункового соку, посідає ацетилхолін. Він виділяється із закінчень аксонів постгангліонарних нейронів інтрамуральних гангліїв шлунка. Секреторна відповідь на дію даного біогенного аміну є видоспецифічною. Всі 5 підтипів мускаринових рецепторів містяться в шлунку, з них М_1-4 – в кислотопродукуючій слизовій. М₁-рецептори показані на головних клітинах і поверхні слизових клітин, М₂- і М₄- рецептори – на D-клітинах, М₃- на парієтальних і G-клітинах, М₅-на постгангліонарних ентеричних нервових волокнах [46]. Пресинаптичні М₁-холінорецептори, що розміщені на нейронах антрального відділу слизового і підслизового шарів шлунка модулюють вивільнення ацетилхоліну [45,46]. Одночасне пригнічення нервових імпульсів в гангліонарних нейронах та зменшення вивільнення ацетилхоліну в парасимпатичних постгангліонарних нейронах призводить до значного зниження секреції шлункових залоз. В літературі є дані, що на ізольованих шлункових залозах кроля секреція, викликана дибутирил цАМФ, посилюється після застосування карбахоліну – синтетичного аналогу ацетилхоліну [47]. При цьому відмічається, що критичним для синергізму холінергічної стимуляції парієтальних клітин з цАМФ є вивільнення внутрішньоклітинного Са²⁺.

Особливе значення серед гуморальних стимуляторів шлункової секреції належить гастрину. Основним субстратом, який містить гастрин, є слизова оболонка антрального відділу шлунка, в якій гормон накопичується, головним чином, в формі гастрину-17 ( складається з 17 амінокислот, активний центр молекули амід С-кінцевого тетрапептиду ), і складає приблизно 90% всього гастрину, який екстрагується. Місце синтезу даного гормону поліпептидної природи - G-клітини в слизовій оболонці шлунка, дванадцятипалій і порожній кишках та в підшлунковій залозі. Основними стимуляторами секреції G-клітин є: білкова їжа, амінокислоти, кальцій, епінефрин, збудження блукаючих нервів, інсулінова гіпоглікемія, механізм розтягнення антрального відділу шлунка, збільшення рН шлункового вмісту та адреналін, що діє на β-адренорецептори гастрин продукуючих клітин, їх аденілциклазу і цАМФ. Вивільнення гастрину відбувається через активацію протеінкінази А, цАМФ і мітоген-активоване фосфорилювання протеінкінази [48]. Найважливішими інгібіторами продукції гастрину є низький рН шлункового соку, а також ряд біологічно активних речовин: соматостатин, шлунковий інгібіторний поліпептид, глюкагон, секретин, вазоактивний інтестинальний поліпептид, глюкагон і кальцитонін. Вивільнення гастрину відбувається за принципом зворотнього зв’язку: у відповідь на дію різних факторів з G-клітин виділяється гастрин, який стимулює секрецію соляної кислоти, а її надлишок інгібує подальший викид гастрину. Гормон впливає на шлункові залози як шляхом прямої стимуляції парієтальних і головних клітин, так і шляхом вивільнення гістаміну і ацетилхоліну – опосередкована стимуляція. Гастрин діє на α-подібні ендокринні клітини , активуючи в них ферменти відповідальні за синтез і виділення гістаміну , котрий в свою чергу впливає на обкладові клітини. Існують складні взаємостосунки між вивільненням гастрину і соматостатину при подразненні блукаючого нерва, споживанні їжі і ссанні. Електрична стимуляція блукаючого нерва викликає поступання гастрину у ворітну вену і зниження рівня соматостатину в плазмі крові. Дослідження останніх років показали, що внутрішньовенне введення гастрину викликає вивільнення греліну Х/А-подібними клітинами шлунка [47,49], який здатний синергічно збільшувати гастринову шлункову секрецію [50]. Авторами показано, що грелін стимулює секрецію кислого шлункового соку через механізм активації еферентних волокон вагуса та шляхом вивільнення гістаміну з ентерохромафінних клітин шлунка. Відомо, що грелінові рецептори присутні в ЦНС і периферичний грелін здатний діяти як ендокринна субстанція на рівні стовбура мозку через заднє поле на латеральній стороні четвертого шлуночка (area postrema) [51]. Рівень греліну в плазмі крові збільшується під впливом мускаринових агоністів, α-адренергічних антагоністів і β-адренергічних агоністів та зменшується під впливом мускаринових антагоністів та α-адренергічних агоністів, а також при ваготомії [52,53,54].

Відомо, що гістамін є одним з природних стимуляторів шлункової секреції [55]. Більшою мірою гістамін стимулює секрецію обкладових клітин шлункових залоз [56], однак дослідження ряду авторів показують, що він стимулює і секрецію головних клітин [57]. Важлива роль в посиленні секреторного ефекту гістаміном належить збільшенню при цьому шлункового кровотоку. На сьогоднішній день гістамінові рецептори першого, другого та четвертого (Н₁, Н₂, Н₄) підтипів знайдені по всій довжині шлунково-кишкового тракту [18]. Н₁- та Н₂- рецептори є також на гангліонарних клітинах мезентеріального плетива. Н₃-рецептори розташовані в слизовій шлунка та кишечника, причому найбільш щільно у фундальному відділі шлунка. Ці рецептори знайдені і на ECL-клітинах . У складі волокон блукаючих нервів показано існування аферентних гістамін-чутливих нейронів [59,60]. Гістамінергічні нейрони і їх терміналі виявлені також в гіпоталамічній області мозку, що дозволяє розглядати гістамін як медіатор нервових імпульсів в центральній нервовій системі . Активація ECL-клітин вважається головним джерелом участі гістаміну в регуляції шлункової секреції. Гістамін може вивільнятись в шлунку при дії гастрину на ССК₂-рецептори на ECL клітинах і стимулювати Н₂-гістамінові рецептори, розташовані на парієтальних клітинах (як і М₃-, ССК₂- та sst₂- рецептори), що призводить до кислої шлункової секреції [61]. Встановлено, що ССК-А рецептори опосередковують класичні ефекти холецистокініну (ССК), тоді як ССК-В рецептори, які спочатку були знайдені в мозку, є ідентичними гастриновим рецепторам, активація яких стимулює шлункову секрецію у собак. Вивільнення гістаміну з ECL-клітин гальмується гастриновими антагоністами та соматостатином . За допомогою PCR-методу підтверджена наявність на ECL-клітинах CCK₂-, sst₂­, sst₅- та D₁- рецепторів. Соматостатин пригнічує діяльність гастринових, ECL- і парієтальних клітин, зв’язуючись з соматостатиновими рецепторами другого типу [62]. Імуногістохімічні і функціональні дослідження показали існування гальмівного зворотнього зв’язку між парієтальними і ECL-клітинами впродовж гастринової стимуляції, що може бути основою шляху низькорівневої регуляції секреції соляної кислоти завдяки взаємодії між цими двома типами клітин.

Отже, описаним стимуляторам властива здатність до потенціації ефектів. На користь цього твердження є дослідження, в яких показано, що стимульована пентагастрином шлункова секреція може бути збільшена супутньою холінергічною стимуляцією [63]. Кислотність шлункового соку визначається балансом між стимулюючими сигналами з гастрин – гістамінових шляхів, з одного боку, і гальмівними сигналами з ССК – соматостатинових шляхів, з іншого боку. Ендогенний соматостатин пригнічує кислу шлункову секрецію, діючи прямо на sst₂-рецептори на парієтальних клітинах та гальмуючи вплив гастрину на ECL-клітини. Функція парієтальних клітин регулюється не тільки циркулюючими гормонами (гастрин, ССК) і паракринними передатчиками (гістамін, соматостатин), але також і нейротрансміттерами з ентеричних нейронів (ацетилхолін, катехоламіни, нейропептиди, такі як гіпофізарний пептид, активуючий аденілатциклазу (РАСАР), вазоактивний інтестинальний поліпептид (VIP), галанін) [62,63].

ECL-клітини мобілізують гістамін у відповідь на адреналін і норадреналін, що діють на β₂-адренорецептори, та на деякі нейропептиди, які зустрічаються в ентеричних нейронах (РАСАР, що діє на РАС₁-рецептори [24] і VIP, який діє на VAPAC₂-рецептори). Галанін гальмує мобілізацію гістаміну з ECL-клітин, викликану гастрином як in vitro, так і in vivo через дію на галанінові рецептори першого типу .

Автори вважають, що одночасна активація різних типів рецепторів на парієтальних клітинах призводить до перехресного перекривання внутрішньоклітинних систем вторинних передатчиків. На ізольованих парієтальних клітинах і кислотопродукуючих залозах свині, щура, мурчака і кролика показано, що ССК₂- та М₃- рецептори зв’язані з G_q тримерним протеїном, який при його стимуляції активує фосфоліпазу С і підвищення рівня інозитолтрифосфату, викликаючи вивільнення внутрішньоклітинного кальцію[65].G_s активує аденілатциклазу і збільшує рівень внутрішньоклітинного цАМФ. Н₂-рецептори зв’язані з обома, G_q і G_s шляхами трансдукції. Крім того, sst₂-рецептори зв’язані з G_i тримерним протеїном, що гальмує G_s шлях в ECL-клітинах, пов’язаний з PAC₁-рецепторами та також G_q шлях в ECL- та парієтальних клітинах, пов’язаний з ССК₂-рецепторами. Це свідчить, що збільшення рівня цАМФ та внутрішньоклітинного кальцію потрібне для стимуляції шлункової секреції [61,66]. На клітинному рівні стимулююча дія ацетилхоліну і гастрину на секрецію шлункового соку здійснюється за участю іонів Са²⁺, тоді як внутрішньоклітинну дію гістаміну пов’язують зі збільшенням вмісту циклічного АМФ в клітині. Значну роль у реалізації функціональної активності секреторних клітин відіграє протеінове фосфорилювання ензимів [67,68].

Дослідження останніх років показали, що шлункова секреція може бути стимульована не тільки через класично відомі нейрональні і гормональні шляхи, але також і через Са²⁺-чутливі рецептори, представлені уздовж всього шлунково-кишкового тракту, в тому числі і на базолатеральних мембранах кислотосекретуючих парієтальних клітин [66,57]. Активація цих рецепторів бівалентними катіонами і агоністами Сd³⁺ приводить до активації Н⁺-К⁺-АТФази та згодом до стимуляції шлункової секреції [69]. Пригнічення гетеротримерних G-протеінів токсином кашлюку впродовж стимуляції Са²⁺-чутливих рецепторів Сd³⁺ тільки частково зменшує спостережуваний стимулюючий ефект на шлункову секрецію. Інкубація шлункових залоз з хелатором внутрішньоклітинного Са²⁺ ВАРТА-АМ зменшує активність Н⁺-К⁺-АТФази і вказує на важливу роль внутрішньоклітинного Са²⁺ в сигнальному каскаді. ТМВ-8, інгібітор вивільнення запасів Са²⁺ з ендоплазматичного ретикулуму, запобігає стимуляції активності Н⁺-К⁺-АТФази. Верапаміл, інгібітор L-типу Са²⁺-каналів, зменшує стимуляцію шлункової секреції. Це свідчить, що як вивільнення внутрішньоклітинного Са²⁺ з ендоплазматичного ретикулуму, так і приток Са²⁺ в клітину залучені до активації Н⁺-К⁺-АТФази, опосередкованої Са²⁺-чутливими рецепторами. Хелеретрин, інгібітор протеінкінази С повністю гальмував стимулюючий ефект Сd³⁺. Фізіологічні ефекти, які здійснюються за участю Са²⁺-чутливих рецепторів, включають регуляцію шлункової секреції і модуляцію транспорту рідин в кишечнику органічними нутрієнтними агоністами цих рецепторів, такими як поліаміни і L-амінокислоти [70].

На ізольованих шлункових залозах людини показано, що ендогенний і екзогенний NO може викликати зменшення шлункової секреції, стимульованої гістаміном [58,61]. Це зменшення супроводжується збільшенням продукції цГМФ в парієтальних клітинах. Таким чином, NO в слизовій шлунка є важливим фактором в регуляції шлункової секреції. Гальмування шлункової секреції, викликане NO, є цГМФ-залежним механізмом, що залучає активацію гуанілатциклази. Інші автори показали стимулюючу дію NO на шлункову секрецію . Показано, що цГМФ в дозі 300 мкмоль посилював нестимульовану, а в дозі 1 ммоль – гальмував гістамінову шлункову секрецію, тоді як цАМФ в дозі 100 мкмоль збільшував соковиділення в ізольованих шлунках мишей [62]. Як цАМФ, так і цГМФ збільшували вівільнення гістаміну з ЕСL клітин, що свідчить про роль їх обох як вторинних месенжерів у цьому процесі. Встановлено, що вплив NO на шлункову секрецію може бути опосередкований вивільненням гістаміну з ЕСL-клітин, а також змінами вивільнення гастрину і соматостатину [63]. При дослідженні рівня оксиду азота в шлунковому соці і основних показників шлункової секреції у людей із захворюваннями верхнього відділу травного тракту між ними виявлено кореляційні зв’язки. Під час секреції шлункового соку посилюється кровопостачання слизової оболонки шлунка, що відбувається за рахунок розширення мікросудин. Причиною вазо дилатації і стимуляції шлункової секреції може бути оксид азоту.

РОЗДІЛ 2

МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Для вирішення поставлених завдань нами був використаний комплекс фізіологічних, хірургічних, фармакологічних та біохімічних методів досліджень. Експерименти по дослідженню секреторної функції шлунка при алкогольному панкреатиті проведені на самках білих лабораторних щурів з вихідною масою 170-200г, при гострому некротичному панкреатиті – на самцях масою 200-260г, а при хронічному некротичному панкреатиті – на самцях таких самих щурів з вихідною масою 190-200г. Тварини знаходилися на звичайному харчовому раціоні віварію, а перед дослідом добу голодували з вільним доступом до води.

Хронічний алкогольний панкреатит у щурів моделювали шляхом споживання тваринами 20% розчину етанолу в якості єдиного джерела пиття впродовж 14 тижнів (n=25) [ ]. Тварини контрольної групи споживали водопровідну воду без обмежень (n=20).

Гострий некротичний панкреатит моделювали шляхом одноразового введення L-аргініну в дозі 2 г/кг маси тіла, внутрішньоочеревинно (n=19) []. Через 24 години після ін’єкції L-аргініну в гострих спробах досліджували шлункову секрецію. Контролем були досліди з внутрішньоочеревинним введенням тваринам відповідного об’єму фізіологічного розчину (n=13).

Хронічний некротичний панкреатит моделювали L-аргініном, застосовуючи його інтраперитоніально за наступною схемою. Перша ін’єкція амінокислоти з розрахунку 5 г/кг маси тіла тварини. Друге введення L-аргініну проводили на четверту добу, третє – на сьому, четверте – на десяту добу після першої ін’єкції амінокислоти; щоразу в дозі 2,5 г/кг маси тіла []. Шлункову секрецію досліджували методом аспірації на одних і тих самих тваринах на десяту (n=12) та шістдесят третю (n=6) доби після останнього введення L-аргініну. Контролем були спроби з внутрішньоочеревинним введенням тваринам фізіологічного розчину за відповідною схемою (n=18), поставлені на десяту та шістдесят третю доби після останньої ін’єкції.

Хронічні досліди проводили методом аспірації. Умови хронічного експерименту дозволяли досліджувати зміни шлункової секреції на одних і тих самих тваринах впродовж тривалого часу без порушень функціонування шлунково-кишкового тракту поза проведенням спроб. В між дослідний період сік шлункових залоз надходив до шлунка, що запобігало розладам травлення і шлункового сокоутворення. Для отримання шлункового вмісту у щурів використовувався тонкий металевий зонд, за допомогою якого в шлунок тварин вводили 2 мл дистильованої води і відразу, не виймаючи зонда, ним відбирали вміст шлунка разом із введеною рідиною. Дослідження біохімічного складу шлункового вмісту за цією методикою здійснювали на різних етапах розвитку алкогольного панкреатиту: після чотирьох, восьми і дванадцяти тижнів від початку алкоголізації, а також на 10 та 63 доби перебігу хронічного некротичного панкреатиту викликаного L-аргініном. Дослідження шлункової секреції за цією методикою дозволяло здійснювати кількісну оцінку біохімічного складу шлункового вмісту, проте не дозволяло одержувати для аналізу шлунковий сік в чистому вигляді, точно визначати кількість продукованого шлунковими залозами секрету в досліді, досліджувати якісний склад секрету, а також характеризувати секреторну функцію шлунка в цілому.

Дослідження секреторної функції шлунка у щурів по закінченню всього терміну алкоголізації (14 тижнів), а також при гострому некротичному панкреатиті ( L- аргінінова модель) проводили методом перев’язки пілоруса за Х.Шеєм та співавторами [ ]. Досліди проводились на наркотизованих тваринах (тіопентал натрію в дозі 35 мг/кг, розчинений в 1 мл фізіологічного розчину, внутрішньоочеревинно) і полягали в наступному. Пошаровий розтин черевної стінки довжиною 2-2,5 см проводили по білій лінії живота на 0,5 см нижче мечоподібного хряща. У рану підтягували шлунок разом із сальником. Між крупними судинами у ділянці пілоричного сфінктера шлунка накладали лігатуру. Після цієї маніпуляції впродовж 4 годин досліду збирали одну порцію шлункового соку, вимірювали її об’єм (мл), рН, вміст в соці соляної кислоти (мкмоль), концентрацію загального білка (мкг/мл) з подальшим розрахунком його дебіту, а також концентрації груп вільних амінокислот (мг%).

Кількість і хімічний склад одержаного шлункового соку порівнювали з таким контрольних спроб. Різниця в показниках рівня шлункової секреції і якості шлункового соку дозволяла певним чином судити про секреторну функцію шлунка за умов гострого та хронічного панкреатитів. Кислотоутворююча функція шлунка характеризується кількістю соляної кислоти в шлунковому соку, у якому вона може знаходитись у вигляді дисоційованих іонів водню і хлору (вільна соляна кислота) або зв’язаною з ж2білками (зв’язана соляна кислота). Існує поняття про загальну кислотність, яке включає в себе суму всіх кислотореагуючих речовин, які знаходяться в шлунку: вільної і зв’язаної соляної кислоти, кислих фосфатів і органічних кислот. Найбільш повне уявлення про кислотоутворюючу функцію обкладових клітин шлунка можна отримати при визначенні показника концентрації вільної соляної кислоти в шлунковому соці .

Концентрацію вільної соляної кислоти в аспіраті (суміш вмісту шлунка з дистильованою водою, яка в нього вводилась) визначали шляхом титрування шлункового вмісту сантинормальним розчином гідроксиду натрію (NaOH) в присутності індикатора диметиламіноазобензолу (0,5% спиртовий розчин). Кислотність шлункового вмісту визначалась кількістю мікролітрів сантинормального лугу, використаного для титрування 0,2–0,5 мл шлункового вмісту з кожної проби, при перерахунку на 100 мл. В подальшому концентрацію соляної кислоти в аспіраті переводили в ммоль/л.

Цільний шлунковий сік, отриманий методом перев’язки пілоруса, центрифугували зі швидкістю 3500 об/хв. впродовж 10-ти хвилин. Надосадову рідину відбирали і вимірювали її рН та вміст загальної соляної кислоти шляхом титрування 0,01 Н розчином гідроксиду натрію до рН 7,0 за допомогою рН метра. Кількість NaOH, використаного на титрування шлункового соку, зібраного за час всього досліду, дорівнювала дебіту загальної соляної кислоти, виділеної залозами шлунка за цей час. Обраховували дебіт НСl, виділеної за 1 год досліду (мкмоль). Дебіт соляної кислоти дозволяє здійснити більш об’єктивну оцінку кислотоутворюючої функції шлунка, оскільки цей показник характеризує кількість соляної кислоти, виділеної обкладовими клітинами за час досліду.

Загальний білок шлункового соку визначали спектрофотометричним методом, який ґрунтується на здатності пептидних зв’язків поглинати ультрафіолетове світло в діапазоні 215-225 нм [ ]. Таким чином, вимірюючи величину оптичної густини при цій довжині хвилі, можна судити про кількість білка, присутнього в розчині.

Для визначення концентрації загального білка в цільному шлунковому соці відбирали 200 мкл секрету і додавали до нього 100 мкл концентрованого (22,5%) аміаку для нейтралізації і осадження соляної кислоти та 1,8 мл охолодженої до 0⁰С суміші ацетону з етанолом у співвідношенні 3:1 для коагуляції білків. Проби охолоджували впродовж 25-30 хв і центрифугували 7 хвилин при 3000 об/хв. Під час центрифугування білок випадав в осад. Депротеїнізовану надосадову рідину (екстракт) зливали у конусовидні пробірки для визначення в ній вмісту гексозаміну та груп вільних амінокислот. До осаду додавали 2,5 мл дистильованої води, ретельно перемішували скляною паличкою і через 1 год досліджували на спектрофотометрі СФ-46 при зазначеній довжині хвилі в кюветі з довжиною оптичного шляху 1 см. В якості контролю використовували дистильовану воду. Розрахунки проводили по калібрувальних кривих, побудованих попередньо за розчинами чистого білка (альбумін сироватки) з відомою концентрацією у перерахунку кількості мкг білка на 1 мл досліджуваного шлункового соку. Дебіт загального білка в шлунковому соці за годину досліду визначали математично, перемножуючи його кількість в одиниці об’єму на величину годинної порції секрету.

Концентрацію загального білка в аспіраті визначали аналогічно. До 600 мкл аспірату додавали 50 мкл концентрованого (22,5%) аміаку та 3 мл ацетон-етанольної суміші, центрифугували, зливали екстракт і додавали до осаду 2,5 мл дистильованої води, перемішували та досліджували на спектрофотометрі. Розраховували кількість мкг білка на 1 мл досліджуваного аспірату.

Надосадову рідину, отриману після осадження білків і центрифугування шлункового соку або аспірату, використовували для визначення концентрацій гексозаміну та груп вільних амінокислот 73,74. Екстракт висушували при температурі 37-40⁰С до сухого залишку, який розчиняли у 50 мкл суміші етанол-вода (1:1). Розподіл груп амінокислот проводили за допомогою хроматографії на папері FN-1 (Filtrac, Німеччина) в системі розчинників ізоаміловий спирт – бутанол - оцтова кислота - мурашина кислота - бензиловий ефір бензойної кислоти – деіонізована дистильована вода (9:4:4:1:2:5). Після фарбування хроматограм нінгідриновим реактивом (0,2%-ий розчин нінгідрину в ацетоні) іх проявляли в закритій від світла камері. Ідентифікацію гексозаміну та груп амінокислот проводили за допомогою стандартів. Кількісну оцінку вмісту гексозаміну та окремих груп амінокислот здійснювали за допомогою денситометра ДО-1М (λ=554 нм) у відповідності до калібрувальних кривих, викреслених з цією метою.

Фактичний матеріал оброблено за допомогою пакету прикладних програм Statistica 6.0 методом варіаційної статистики з урахуванням t-критерію Стьюдента, оскільки дані мали нормальний розподіл при перевірці їх за тестом Шапіро–Уілка. Достовірними вважалися відмінності між контролем і дослідом при р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТИ ТА ОБГОВОРЕННЯ