5.Идентификация веществ на хроматограмме (качественный анализ)
Положение отдельных хроматографических зон характеризуется и определяется величиной Rf (Rate fraction – скорость фракции), являющейся качественной характеристикой определяемого вещества.
Качественный анализ проводят, сравнивая полученные по хроматограмме значения Rf с табличными данными. Однако идентификация веществ по табличным значениям часто бывает затруднена и даже невозможна, т.к. на воспроизводимость влияет ряд факторов:
а)качество растворителей, их чистота;
б)качество сорбента и приготовленного тонкого слоя;
в)активность сорбента;
г)техника эксперимента (количество нанесенного образца, способ хроматографирования, навыки экспериментатора и др.).
Поэтому для надежности часто используют хроматографирование «со свидетелем», когда на пластинку параллельно с пробами наносят «свидетель» - вещество, наличие которого предполагают в пробе. Если Rf свидетеля совпадает с Rf компонента пробы, то можно утверждать, что этот компонент присутствует в пробе.
где – l(A),l(B) – расстояние, пройденное анализируемыми веществами А и В;
Для симметричных пятен пройденное расстояние определяют по положению центра пятна, для несимметричных – по положению максимума интенсивности.
6.Количественный анализ
Можно выделить 2 группы методов:
Прямые (непосредственно на хроматограмме),
Непрямые (после выделения вещества из тонкого слоя).
Прямые методы могут быть
а)неинструментальными, б)инструментальными.
а)При неинструментальном методе сравнивают площадь пятен анализируемых веществ со стандартом. Готовится серия стандартных растворов, производится хроматографирование и площадь зон измеряется планиметром или с помощью миллиметровой бумаги. Строится калибровочный график и по этому графику определяется масса компонента в растворе пробы. Метод чувствителен: можно обнаружить10-20 мкг вещества с точностью 5-7%.
б)При инструментальном методе часто используют денситометры: в основе лежит измерение оптической плотности разделенных зон. Монохроматический поток электро-магнитного излучения фокусируется оптической системой прибора на хроматографическую пластинку. Сканирующее устройство позволяет перемещать пластинку в 2-х направлениях: параллельно движению подвижной фазы и перпендикулярно, поэтому сфокусированный луч «прощупывает» всю пластинку. С помощью двух фотодетекторов измеряют интенсивность поглощения или отражения света в каждой части пластинки. Регистратор фиксирует зависимость этих величин в виде денситограмм, по которым определяют величины Rf (качеств. анализ) и количество определяемых компонентов.
Непрямые методы: если хроматограмма получена на бумаге, то вырезают часть с зоной компонента пробы и затем экстрагируют исследуемое вещество подходящим растворителем. Если хроматограмма получена на пластинке, то снимают слой сорбента с веществом и вымывают адсорбированное вещество. Полученный раствор анализируют инструментальным методом с высокой чувствительностью (например спектрофотометрия, полярография и др.).
Примеры анализа вытяжек из различных лекарственных растений на содержание определенных классов соединений:
Пластинка «Силуфол» (связывающий компонент – крахмал),
Подвижная фаза – система растворителей СНСI3 : С2Н5ОН (9:1)
1)Алкалоиды (свидетели: растворы атропина и скополамина). После хроматографирования подсушивают под тягой и помещают в эксикатор, насыщенный парами иода. Алкалоиды обнаруживаются в виде бурых пятен.
2)Антраценпроизводные. Окисленная форма дает вишнево-красное окрашивание со щелочью и аммиаком (р. Борнтрегера). После хроматографирования пластинку подсушивают и смотрят в УФ-свете до и после проявления парами аммиака.
3)Кумарины (свидетель: раствор известного кумарина). После хроматографирования пластинку подсушивают вначале под тягой, а потом при температуре 100-120оС. Просмотр в УФ-свете: в зависимости от структуры зоны флуоресцируют ярко-голубым, зелено-голубым, фиолетовым, зеленым цветом. Далее проявление:
а)10%-ным NаОН в СН3ОН с последующим подсушиванием при 100-120оС;
б)опрыскивают диазотированной сульфаниловой кислотой. Появляются пятна кумаринов от оранжево-красного до сине-фиолетового окрашивания.
Бумажная хроматография (БХ).
Теоретические положения, используемые в ТСХ, полностью распространяются на БХ.
Принципиальные отличия:
1)БХ по скорости элюирования значительно уступает ТСХ (обычно разделение длится несколько часов;
2)не все реактивы, используемые для проявления в методе ТСХ, годятся для БХ (в силу их химической агрессивности).
Варианты хроматографирования:
а)восходящее, б)нисходящее, в)горизонтальное, г)двустороннее.
Используют специальную бумагу для хроматографирования. Реже – фильтровальную бумагу (для горизонтального хроматографирования).
Пример применения БХ при анализе природных БАС (биологически-активных соединений):
Флавоноиды: спиртовое извлечение концентрируют упариванием, наносят на круглый диск хроматографической бумаги на расстоянии 0,5 см от центра. Свидетели (спиртовые растворы рутина, кверцетина и др.) наносят так же; диаметр пятен не более 5 мм. В центр диска вводят фитиль из хроматографической бумаги, по которому растворитель (15%-ный СН3СООН) поступает на круглый диск. Проводят в чашке Петри, экспозиция 20-25 мин. Высушивают бумагу до испарения растворителя и смотрят в УФ-свете (вначале без проявления, а затем после проявления AlCI3 и парами NH3).