2.Нанесение анализируемой пробы

Для нанесения пробы используют специальные микропипетки или калиброванные капилляры. Диаметр стартового пятна не должен превышать 3-4мм, иначе на конечной хроматограмме будут большие, расплывшиеся зоны, которые могут перекрывать друг друга. На расстоянии 1-1,5 см от нижнего края пластинки обозначается линия тарта. Пробы наносят на расстоянии 1 см друг от друга.

3.Хроматографирование в системе растворителей

При выборе растворителей для подвижной фазы учитывают их элюирующую способность (способность вытеснения ими адсорбированных соединений с сорбента). Существует несколько элюотропных рядов: Траппе, Стрейна и др. Например, элюотропный ряд растворителей по Траппе составлен в порядке увеличения их полярности и элюирующей способности: циклогексан, ССI₄ , С₂Н₃СI₃ , толуол, бензол, С₂Н₄СI₂ , (С₂Н₅)₂О, этилацетат, ацетон, С₃Н₇ОН, С₂Н₅ОН, СН₃ОН , Н₂О.

Обычно используют смесь нескольких растворителей с разной полярностью, чтобы реализовать как можно больше типов взаимодействия между исследуемым веществом и подвижной фазой.

Хроматографирование проводят в камерах с герметично закрывающейся крышкой и насыщенных парами растворителя; вдоль стенок помещают фильтровальную бумагу, пропитанную растворителем. Это предупреждает «краевой эффект»: явление, когда одно и то же вещество в середине хроматограммы передвигается медленнее, чем по краям. Варианты хроматографирования:

а)Восходящее (используют чаще всего). Пластинки располагают в камере под углом от 10-15^о (незакрепленный слой) до почти 90^о (закрепленный слой) и растворитель поступает снизу вверх. Стартовая линия находится внизу; силы капиллярные.

б)Нисходящее хроматографирование, когда растворитель поступает сверху вниз, обычно проводят при анализе медленно передвигающихся по тонкому слою сорбента соединений. Стартовая линия находится вверху, пластинки устанавливают вертикально. Силы капиллярные и гравитационные.

в)Горизонтальное хроматографирование применяется в основном в радиальной хроматографии, когда используют круглые пластинки, а подвижная фаза подается в центр пластинки и хроматограмма развивается от центра к периферии. Силы капиллярные.

г)Двустороннее хроматографирование – делается дважды: вначале линия старта размечается с одной стороны и поле хроматографирования делается проявление. А затем линия старта наносится сбоку и опять производится хроматографирование под углом 90^о. Если после повтора зоны совпадают и располагаются по диагонали, то следовательно в исследуемом образце отсутствуют новые вещества.

4.Детектирование (проявление) хроматограмм

Если вещества окрашены, то обычно проявление не требуется. Для неокрашенных зон проводят детектирование.

1.Химический способ: пластинку опрыскивают из пульверизатора реагентом, образующим с определяемым веществом окрашенное соединение. Реагенты бывают универсальные и специфические.

Универсальные. Например для анализа лекарственных веществ основного характера, обусловленного наличием гетероциклического азота или соединений, содержащих вторичный или третичный азот (амидопирин, новокаин, анестезин, антипирин, дибазол, кодеин и др.) используют:

а)H₂SO_{4 (конц.)} – окраска обусловлена дегидратацией соединений; не применяется на слоях с крахмалом из-за обугливания.

б)Фосфорномолибденовая кислота – окраска обусловлена реакцией восстановления молибденовой кислоты.

в)I₂ – бурые пятна, проявленные на хроматограмме, обусловлены протеканием ОВР.

Специфические. Реагенты используют для проведения реакций на какую-либо функциональную группу.

2.Физический способ проявления основан на способности ряда соединений (например ароматических) флуоресцировать под действием УФ-лучей. Пластинку рассматривают на приборе хроматоскопе, отмечают цвет отдельных зон в видимом и УФ-свете.

Занятие 3 - Лекция 3.