Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Регенерация тканей и хитозан
.pdf
Государственное бюджетное образовательное учреждение
высшего профессионального образования
«Тверская медицинская академия»
Министерства здравоохранения России
Г.В. Хомулло, О.М. Довгилева, М.Б. Петрова
Регенерация тканей
и хитозан
Тверь 2013
УДК 616–003.93:547.995
ББК 28.03
Р 325
А в т о р ы :
Хомулло Галина Васильевна – доктор медицинских наук, профессор, заслуженный работник Высшей школы Российской Федерации, профессор кафедры
биологии ГБОУ ВПО Тверская ГМА МЗ РФ;
Довгилева Ольга Михайловна – кандидат медицинских наук, ведущий офталь-
молог Первой УКБ ОАО РЖД НУЗ Научно-клинический Центр;
Петрова Маргарита Борисовна – доктор биологических наук, профессор, зав.
кафедрой биологии ГБОУ ВПО Тверская ГМА МЗ РФ.
Р е ц е н з е н т ы :
Баженов Дмитрий Васильевич – член-корр. РАМН, президент Международной ассоциации морфологов, зав. кафедрой анатомии человека ГБОУ ВПО
Тверская ГМА Минздрава России, доктор медицинских наук, профессор;
Костюкевич Сергей Владимирович – зав. кафедрой медицинской биологии
ГБОУ ВПО Северо-Западный Государственный Медицинский Университет
им. И.И. Мечникова Минздрава России, доктор медицинских наук, профессор.
Хомулло Г.В., Довгилева О.М., Петрова М.Б.
Р 325 Регенерация тканей и хитозан. – Тверь: ООО «Издательство
«Триада», 2013. – 132 стр.
ISBN 978-5-94789-606-0
В монографии обобщены результаты многолетних собственных исследований и литературные данные, посвященные изучению влияния хитозана на посттравматическую регенерацию кожи животных. Морфологические особенности
тканей регенерата изучались в динамике и на всех уровнях структурной организации – от субклеточного до организменного. Одновременно с морфологическими
изменениями в условиях применения хитозана изучалась динамика некоторых
биохимических показателей, в частности, фосфатидилинозитов и их фосфорилированных форм – соединений, принимающих непосредственное участие
в реализации различных этапов заживления ран кожи. Все исследования выполнены в лабораториях Научно-исследовательского Центра ГБОУ ВПО Тверская
государственная медицинская академия Минздрава России. Монография предназначена для врачей-хирургов, морфологов, исследователей, занимающихся
изысканием новых способов стимуляции заживления ран, студентов старших
курсов медицинских вузов.
ISBN 978-5-94789-606-0
© Г.В. Хомулло, О.М. Довгилева, М.Б. Петрова, 2013
© Оформление, издание ООО «Издательство «Триада». 2013
Содержание
Список основных сокращений ............................................................ 5
Введение ...................................................................................................... 6
Глава 1. Хитозан и его основные характеристики ........................ 7
1.1. Получение, структура, физико-химические
свойства и применение хитозана ................................................. 7
1.2. Влияние хитозана на процессы регенерации
и клеточный метаболизм ..............................................................15
Глава 2. Методические подходы к изучению влияния
хитозана на скорость и характер заживления ран кожи ...........27
2.1. Создание модели полнослойного раневого
дефекта кожи .................................................................................... 27
2.2. Цитологическое изучение раневого экссудата.............. 29
2.3. Микроскопическое исследование
биопсированного материала........................................................ 29
2.4. Ультраструктурное изучение фибробластов
грануляционной ткани ..................................................................30
2.5. Определение содержания фосфоинозитидов
в цельной крови и грануляционной ткани .............................31
2.6. Статистическая оценка результатов эксперимента ..... 34
Глава 3. Морфофункциональная характеристика
репаративной регенерации кожи в условиях применения
хитозана ...................................................................................................... 35
3.1. Основные закономерности репаративной
регенерации кожи ...........................................................................35
3.2. Влияние хитозана на цитологический состав
раневого экссудата .......................................................................... 39
3
3.3. Морфологические изменения и характеристика
регенерирующих структур полнослойных ран кожи
при воздействии хитозаном .........................................................47
3.4. Ультраструктурная характеристика
фибробластов грануляционной ткани в условиях
использования хитозана ...............................................................62
Глава 4. Динамика содержания фосфоинозитидов
на различных этапах заживления ран кожи в условиях
воздействия хитозаном ......................................................................... 73
4.1. Метаболизм фосфоинозитидов и их роль
в процессах посттравматической регенерации .....................73
4.2. Изучение динамики фосфоинозитидов в цельной
крови на различных этапах посттравматической
регенерации кожи при применении хитозана ....................... 79
4.3. Изменение содержания фосфоинозитидов
в грануляционной ткани на различных этапах
репарации ран кожи при использовании хитозана .............83
Заключение. Анализ результатов изучения влияния
хитозана на репаративные процессы в коже .................................87
Литература ................................................................................................ 99
4
Список основных сокращений
АК – арахидоновая кислота
ДА – дезацетилирование
ДГ – диацилглицерол
ММ – молекулярная масса
ПГ – простагландины
ФИН – фосфоинозитиды
ФИ – фосфатидилинозиты
ФИФ – фосфатидилинозит-4-фосфаты
ФИФ1 – фосфатидилинозит-3-фосфаты
ФИДФ – фосфатидилинозит-4,5-дифосфаты
IP
– инозитолтрифосфаты
3
5
Введение
На современном этапе развития медицины оптимизация заживления повреждений, вызванных механическими воздействиями (ссадины, раны, оперативные вмешательства), действием крайних температур (ожоги, обморожения) и другими повреждающими факторами (гнойно-воспалительные процессы,
потертости, опрелости, дистрофические нарушения) остается
актуальной научно-практической задачей. В связи с тем, что искусственно синтезированным лекарственным средствам свойственны различные проявления побочных эффектов, в последние
годы возник теоретический и практический интерес к веществам
биогенного происхождения, в том числе и хитозану [82, 91–94,
96, 103, 104, 241].
Хитозан – уникальный природный биополимер, полученный
впервые из хитина ракообразных в 1859 году. Хитозан разрушается в организме человека и животных до обычных для них
веществ: N-ацетилглюкозамин или глюкозамин [191] и обладает
иммуномодулирующим, противомикробным, фунгистатическим,
радиозащитным, противовоспалительным, гипохолестеринемическим, гемостатическим действиями [7, 23, 81, 103, 215, 309].
Однако изучение влияния хитозана на процессы посттравматической регенерации на всех уровнях структурной организации
до сих пор не проводилось.
Особое значение, наряду с морфологическими изменениями
в условиях применения хитозана, имеет изучение динамики биохимических показателей, в частности, фосфатидилинозитов и их
фосфорилированных форм – соединений, принимающих непосредственное участие в реализации различных этапов заживления
ран кожи, которые могут отражаться не только их изменениями
в регенерирующей ткани, но и цельной крови.
6
Глава 1
Хитозан и его основные характеристики
1.1. Получение, структура, физико-химические свойства
и применение хитозана
За последние тридцать лет одним из важнейших достижений
научно-технического прогресса в области изыскания новых перспективных препаратов стало изучение, создание и внедрение
в медицинскую практику хитина, хитозана и его производных.
Хитозан является уникальным природным полимером, который получают из хитина ракообразных. Впервые хитин был обнаружен в клетках крыльев майского жука в 1811 году H. Braconnot
и A. Odier. Получен хитозан в 1859 году С. Rouget, но свое современное название получил лишь в 1894 году (F. Hoppe-Seyler).
В последующие годы к хитину и его производным проявился
заслуженный интерес. В частности, F. Fisher (1903) синтезировал
этот глюкозамин, P. Karrer (1929) провел деградацию хитина
с помощью хитиназ, а W.H. Howorth (1939) установил абсолютную конфигурацию глюкозамина [191].
По внешнему виду хитозан представляет собой чешуйки размером менее 10 мм или порошкообразующую массу от белого
до кремового цвета с желтоватым, сероватым или розоватым
оттенком, без запаха, с вяжущим вкусом [124, 191].
Наиболее распространенным сырьевым источником получения хитина являются панцири промысловых ракообразных,
хотя возможно также использование гладиуса (скелетной пластинки) кальмаров, сепиона каракатицы [16, 145, 185], биомассы
мицелярных и высших грибов [183, 184]. В свою очередь, насекомые (тутовый шелкопряд, медоносные пчелы, комнатные
мухи), вследствие их быстрого воспроизводства, также могут
обеспечить значительную биомассу хитина [76, 257, 360]. Вместе
с тем, за счет широкого развития пчеловодства в России, подмор
пчел также может рассматриваться как новый перспективный
7
источник хитина и хитозана наряду с традиционными способами
получения [23, 76].
По химической структуре хитин – линейный аминополисахарид, состоящий из N-ацетил-2-амино-2-дезокси-D-гликопиранозных звеньев. Он близок к целлюлозе и только ей уступает
по распространенности в природе. Хитин нерастворим в воде,
разбавленных кислотах, щелочах, спиртах и других органических
растворителях. Он растворим в концентрированных растворах
соляной, серной и муравьиной кислот, а также в некоторых солевых растворах при нагревании, но при этом он заметно деполимеризуется [191].
В основе получения хитозана лежит реакция отщепления
от структурной единицы хитина N-ацетил-D-глюкозамина ацетильной группы, или реакция дезацетилирования (ДА), глубину
которой принято оценивать по величине степени ацетилирования – Fa или по величине степени дезацитилирования (1-Fa).
В зависимости от условий реакции получаются хитозаны, существенно различающиеся величиной Fa. Реакция ДА, наряду
с отщеплением ацетильных групп, сопровождается также одновременным разрывом гликозидных связей полимера, характеризующихся уменьшением молекулярной массы (ММ), изменением надмолекулярной структуры и степени кристалличности.
Таким образом, хитозан представляет собой полидисперсный
по ММ и по Fa полимер D-глюкозамина, содержащий 5–15%
ацетамидных групп, а также до 1% групп, соединенных с амнокислотами и пептидами [122, 123]. На величину ММ и структуру хитозана оказывает влияние степень деминерализации и депротеинирования хитина. Отсутствие стадии деминерализации
способствует получению более высокомолекулярного хитозана
[22, 90]. Вместе с тем, ММ хитозана (низкая, средняя, высокая)
изменяет состав интерполиэлектролитных комплексов [113].
Известно, что при получении хитозана стандартного процесса ДА хитина не существует [191]. В большинстве случаев для
его синтеза используют концентрированные растворы NaOH
в широком диапазоне концентраций (от 35 до 50%), температур
8
(от 20° до 140°), гидромодалей (от 3:1 до 10:1) и времени обработки (от 0,5 до 10 суток). Однако существуют и другие способы получения хитозана (радиолиз, ультразвук, микроволновое
облучение, электрохимическая обработка).
Несмотря на разнообразие этих методов активации, всех их
объединяет общий механизм, основанный на влиянии активных
радикалов, окислителей и других частиц, образующихся в процессе радиолиза, ультразвуковой обработки воды, электролиза
на молекулы хитина и хитозана. Так, Takeda М., Tamida T. (1969)
разработали способ, при котором хитин обрабатывают в инертной атмосфере гидроксиламином при рН = 13 и температуре
100 °С в течение 10–20 часов. Основными недостатками этого
способа являются низкая степень дезацетилирования (70%),
длительность обработки, а также наличие деструкций основной цепи полимера. Способ ДА хитина гидразингидратом [191]
предусматривает двух-четырех часовую обработку хитина при
120–150 °С. При минимальной деструкции хитина достигается
степень дезацетилирования 90–97%. Кроме того, дезацетилирование хитина можно провести с помощью ферментов – дезацетилаз микробиологического происхождения. В свою очередь, хитиназы бактерий являются самыми распространенными
из ферментов для получения хитоолигосахаридов. Последние
широко распространены среди микроорганизмов [265, 316, 346]
и обладают способностью адсорбироваться на субстрате (хитине или хитозане) за счет связывающего участка в молекуле
самого фермента [300]. Применение ферментных препаратов
для деградации хитозана позволяет получать низкомолекулярные хитозаны и олигомеры, растворимые в воде и обладающие
при этом на порядок более высокой биологической активностью
по сравнению с высокомолекулярными хитозанами [74]. На основе низкомолекулярных хитозанов разработаны эффективные
радиопротекторы, антикоагулянты с высокой гепариновой активностью.
После ДА и отмывки до нейтрального значения рН хитозан представляет собой сильно гидратированный, набухший
9
продукт с содержанием воды более 70%. Для предотвращения
ороговения хитозан сушат при 50–55 °С. Известно, что для использования хитозана в качестве субстрата для таблетирования
и капсулирования необходимо измельчить его до размера частиц
100–200 мкм [191].
Хитозан является природным, положительно заряженным
полисахаридом, который способен вступать в интерполиэлектролитные реакции с отрицательно заряженными белками, гликопротеинами и гликолипидами. Данный природный биополимер растворяется в слабых растворах как органических, так и минеральных кислот, а на структуру и свойства его влияют сырьевые источники, степень очистки хитина от белка, минеральных
примесей и условия изготовления. Так, при обработке хитозана
муравьиной кислотой получены пленки толщиной 18–22 мкм,
которые были испытаны в качестве мембран. В связи с этим недавно разработанный метод твердофазной модификации хитозана карбоновыми кислотами представляется экологически более
приемлемым [121, 156]. Известно, что интерполиэлектролитные
комплексы на основе хитозана и эудрагита (L 100) могут использоваться в качестве новых полимерных носителей [113].
Благодаря алкилированию хитозана, в частности, его карбоксилметилированию, хитиновые производные могут растворяться
в воде, обладать способностью к волокно- и пленкообразованию.
В исследованиях ряда авторов показано, что для увеличения
растворимости хитина и хитозана в водных средах используют
N- и O-карбоксиметилирование [42, 191, 317, 319] и сульфатирование [22, 255, 318], что делает удобным их использование
и расширяет области практического применения [225, 325, 363].
Гидрофобное модифицирование водорастворимых производных хитозана путем ковалентного присоединения алкильных
или других гидрофобных функциональных групп, придает этим
полиэлектролитам амфифильные свойства, делая их поверхностноактивными [252, 261, 356].
Особый интерес для практического использования представляет свойство водорастворимых анионных и катионных произ-
10
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]