Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Регенерация тканей и хитозан
.pdf
продукция окиси азота ими in vitro, а также лейкоцитоз периферической крови [23, 364]. Эти данные позволяет использовать
хитозан как иммунопотенциатор для предупреждения послеоперационной иммуносупрессии [257, 302].
Наибольший интерес представляют результаты исследований
K. Nishimura et al. (1984, 1986), в которых показана высокая биологическая активность хитозана со степенью дезацетилирования
70%. Введение вещества мышам способствует активации макрофагов и нейтрофильных лейкоцитов. Аналогичные данные получены и в опытах на крысах, доказавших, что в процессе регенерации ран кожи увеличивается функциональная активность макрофагов, стимулируется синтез цитокинов, а также усиливается
их ферментативная деятельность [259–261]. Так, M. Otterlei et
al. (1994) отмечали повышенный синтез под действием хитозана
моноцитами человека фактора некроза опухоли альфа (ФНО-α).
T. Mori et al. (1997) в культуре фибробластов определяли индукцию интерлейкина-8 при действии хитина и его дериватов.
Y. Shibata et al. (1997) на основании данных, полученных in vivo
и in vitro, пришли к выводу о том, что активация альвеолярных
макрофагов у мышей под действием хитозана отчасти опосредуется через γ-интерферон, продуцируемый NK-CD4-клетками.
В ряде исследований [290, 330] доказано, что применение интраназального введения антигена адсорбированного на хитозане,
в опытах на мышах создавало условия для уменьшения аллергического воспаления в дыхательных путях, за счет опосредованного
воздействия на выработку цитокинов (интерлейкина-4, -5, -10).
Особый интерес заслуживают исследования, характеризующие течение различных этапов посттравматической регенерации
кожи при использовании хитозана [285, 286, 304, 344]. В частности, в экспериментах на кроликах при трансплантации кожи
с использованием так называемой «искусственной кожи», содержащей хитозан, отмечается заживление без нагноений и кровоизлияний [178, 271].
В течение последних лет активно разрабатываются полимерные покрытия на основе хитозана и его производных при
21
лечении ран [150, 151]. Так, в работе Юдановой Т.Н. (2006) предложено использовать хитозан в составе коллагеновых раневых
покрытий. При этом антимикробное вещество (сульфадиазин
серебра), входящее в состав хитозанового покрытия, способствовало выделению вещества в первый день в ударной дозе, а затем
с меньшей скоростью, что может оказывать положительное влияние на заживление ран [221, 222].
Известно, что наибольший эффект для ускорения заживления
ран можно достигнуть, если инкапсулировать в пленки, содержащие хитозан, лекарственную «начинку». В качестве последней обычно используются обезболивающие, антибактериальные
и гемостатические препараты, антиоксиданты, факторы роста,
протеолитические ферменты [213, 227, 229, 231]. В иисследовании V. Yu. Nikitin et al. (1994) показано, что хитозан активирует
фагоцитоз микроорганизмов и увеличивает количество мигрирующих фагоцитов в очаг воспаления. Одновременно установлено,
что под влиянием вещества ускоряется инфильтрация полиморфноядерными лейкоцитами области раневого дефекта на ранней
стадии заживления [263].
J.H. Yeo et al. (2000) в опытах на крысах при использовании
хитозана обнаружили ускорение заживления кожного повреждения, включая дерму. Одновременно происходит абсорбция экссудата, увеличение скорости врастания сосудов в подлежащие
ткани, уменьшение выраженности воспалительного процесса
[357].
Экспериментальные исследования отдельных авторов посвящены изучению влияния хитозана на характер и сроки образования грануляционной ткани. Результаты этих исследований
носят противоречивый характер. В некоторых работах установлено, что использование хитозана не оказывает стимулирующего эффекта на заживление ран. В частности, Okamoto Y. et al.
(1995) в опытах на собаках отметили отсутствие статистически
значимых различий при макроскопическом и гистологическом
исследованиях в скорости образования грануляционной ткани
и эпителизации повреждений [276].
22
Однако подавляющее большинство исследований в этом
направлении свидетельствует о выраженном стимулирующем
действии хитозана на скорость развития грануляционной ткани
и окончательные сроки заживления. Так, в работах некоторых
авторов установлено, что хитозан создает благотворные условия
для более раннего формирования грануляционной ткани, что
предполагает возможность использования его при обширных
повреждениях [63, 178, 244, 366, 369].
Доказано, что применение хитозановой пленки на гидрогелевой основе приводит к быстрому формированию новообразованных сосудов, активирует функции фибробластов и тем
самым ускоряет течение пролиферативной стадии заживления
[298]. Аналогичные результаты получены J.F. Soukur, R.O. Fridel
(1978), которые доказали, что применение хитозана приводит
к быстрому увеличению количества и усилению функциональной активности фибробластов, что создает благоприятные условия для течения пролиферативной фазы регенерации [277,
347]. Стимулирующий эффект хитозана установлен и в опытах
на животных H. Ueno et al. (2001). Авторы доказали, что при
использовании хитозана со степенью дезацетилирования 18%
наблюдается усиленная миграция полиморфноядерных лейкоцитов в очаг повреждения, выраженное развитие грануляций
и усиление функций фибробластов [263, 367].
Исследования Mizuno K. (2003), проведенные на мышах,
свидетельствуют о том, что добавленный фактор роста фибробластов к раствору гидроксипропил хитозана при нанесении
на полнослойные кожные раны в виде пленки приводит к быстрому увеличению количества фибробластов в ране с развитием
обильных, хорошо развитых грануляций [273]. При использовании хитозан-агглютинат комплекса в процессе заживления ран
наблюдается ускоренное развитие зрелой эпидермальной ткани
разной толщины [248, 249, 264].
Имеются данные, свидетельствующие о стимулирующем
влиянии хитозана на свойства формирующейся в этих условиях рубцовой ткани, а также на процессы эпителизации [23, 169,
23
249, 280]. Так, Gingras M. (2003) в экспериментальных исследованиях выявил, что при использовании мази, содержащей гепарин-хитозановый комплекс, стимулируется заживление кожных
повреждений и регенерация придатков кожи с восстановлением
нормального строения сальных желез [284]. Аналогичные данные получены и в опытах на крысах [367, 368, 371]. Доказано,
что гель с таурином и хитозаном увеличивает предел прочности
раны, а также эффективен при заживлении кожных повреждений, как поверхностных, так и полученных вследствие лучевого
повреждения, химическими средствами и действиями крайних
температур [231].
При комбинированном использовании хитозана на гидрогелевой основе в комбинации с ультрафиолетовым облучением
полнослойной кожной раны у мышей отмечается быстрое сокращение площади раны, ускоренное формирование грануляционной ткани, а также стимулируется эпителизация [166, 171].
Ускорение роста молодого эпителия и увеличение синтеза коллагена в дерме отмечено и в исследованиях C.A. Stone et al. (2000),
F.L. Mi et al. (2001).
Приведенный нами обзор литературы свидетельствует о том,
что данные о роли хитозана в регуляции репаративных процессов весьма ограничены. Исследования, проводившиеся в этом
направлении, касались только изучения воздействия хитозана
на скорость осуществления отдельных этапов заживления и активность различных клеточных элементов, участвующих в этом
процессе. Опубликованы лишь краткие сообщения, посвященные
исследованию нейтрофильных лейкоцитов, макрофагов, фибробластов, принимающих активную роль в формировании новообразованных тканей на различных этапах заживления ран [263, 273,
367]. Представленный в работах фактический материал не дает
возможности констатировать факт стимуляции восстановительного процесса при воздействии хитозаном, что и определило необходимость постановки нами новых экспериментов [276, 345].
В наших исследованиях была поставлена задача изучить
скорость, способы и характер посттравматической регенерации
24
кожи крыс в условиях применения хитозана. Основное внимание
мы уделяли изучению действия хитозана на все этапы восстановительного процесса, а именно, стадию воспаления, формирования грануляционной и соединительной ткани, эпителизации
раневого дефекта. Мы предполагали проследить динамику репаративного процесса на различных уровнях структурной организации новообразованных тканей регенерата. С целью реализации
этих задач нами было предпринято комплексное исследование,
включающее использование ряда различных методик.
Анализ скорости репаративных реакций сочетался с изучением тех микроскопических изменений в картине заживления,
которые отражают последовательные стадии раневого процесса:
цитологического состава раневого отделяемого, количественной
и качественной характеристики грануляционной ткани, а также
скорости и способа регенерации эпителия.
Одновременно мы ставили задачу выяснить влияние хитозана на скорость и характер метаболических реакций в организме
и регенерирующих структурах, определяющих интенсивность
течения посттравматической регенерации кожи. С этой целью
исследовалось содержание фосфоинозитидов и их производных
в крови и грануляционной ткани при заживлении полнослойных хирургических ран кожи в условиях применения хитозана.
Изменения содержания фосфоинозитидов могли быть дополнительным критерием в оценке уровня обменных процессов в целом организме и регенерирующей коже.
Завершающим этапом в изучении морфофункциональных
особенностей репаративного процесса в коже при воздействии
хитозаном явилось электронномикроскопическое исследование
фибробластов грануляционной ткани. Оно позволило выяснить
значение отдельных ультраструктурных компонентов клетки
в реализации стимулирующего эффекта хитозана при заживлении ран кожи.
Мы полагали, что применение комплексного подхода к изучению динамики репаративного процесса с использованием общеморфологических, цитологических, гистологических, элект-
25
ронномикроскопических и биохимических методик в сочетании
с точным количественным учетом изменений позволит создать
более полное представление о роли хитозана в процессе заживления экспериментальных ран кожи. Полученные материалы,
по нашему мнению, могут способствовать дальнейшему расширению наших представлений о биологической роли хитозана
у животных при наличии у них репаративного процесса.
26
Глава 2
Методические подходы к изучению
влияния хитозана на скорость
и характер заживления ран кожи
2.1. Создание модели полнослойного раневого дефекта кожи
Наши исследования проведены на 142 беспородных белых
крысах-самцах средней массой 152 грамма. Животные содержались в виварии в индивидуальных металлических клетках
в одинаковом световом, температурном режимах и получали
обычный рацион питания согласно установленным нормам. Все
эксперименты выполнены в осенне-зимний период. Животных
выводили из эксперимента под эфирным наркозом с соблюдением правил эвтаназии.
Экспериментальные полнослойные кожные раны наносились
однотипно животным всех серий. Операция проводилась под
эфирным наркозом. На спине в межлопаточной области на участке, превышающем размеры будущей раны, вначале выстригался,
а затем с помощью безопасной бритвы тщательно выбривался
волосяной покров. На операционное поле, обработанное спиртом, прикладывался предварительно смоченный йодом трафарет
квадратной формы со стороной, равной 1,5 см. По границе отпечатка ножницами вырезали лоскут кожи вместе с подкожной
2
жировой клетчаткой площадью 225 мм
ходило открытым способом.
Все животные делились на две серии. Первая серия (контрольная) – на рану ежедневно наносилось вазелиновое масло.
Животным второй серии на область повреждения применялась
суспензия хитозана на льняном масле.
В качестве критериев оценки скорости заживления ран использовали методы макроскопического наблюдения и планиметрии (измерение площади кожного дефекта в динамике). При
визуальном осмотре определяли степень выраженности и про-
. Заживление ран проис-
27
должительность гнойно-воспалительных процессов в области
раны, наличие отека, инфильтрацию и гиперемию окружающих
рану участков неповрежденной кожи, наличие и характер раневого отделяемого, сроки очищения раны от гнойно-некротических масс, характеристику струпа, появление грануляций, начало
и окончание эпителизации.
Планиметрия проводилась ежедневно путем измерения
площади раневой поверхности по методике Б.М. Морозова
и А.Г. Стригановой. На область раны накладывалась прозрачная бумага и на нее остро отточенным мягким карандашом наносились контуры раневого дефекта. Затем они фиксировались
на миллиметровой бумаге и вычислялась площадь раны в мм
2
путем подсчета числа целых квадратов и их половинок.
Хитозан наносился на раневую поверхность в виде 1% суспензии на льняном масле. Для этого на чашечных весах взвешивали
1 грамм хитозана с молекулярной массой равной 26 000, который
затем добавляли к 100 миллилитрам льняного масла при помешивании на водяной бане. Полученный масляный раствор хранился
в герметичном светонепроницаемом сосуде в сухом закрытом
помещении при комнатной температуре. Соблюдение данных условий хранения необходимо потому, что на свету наблюдается потемнение хитозана, снижение его растворимости, а вследствие его
гигроскопичности при повышенной влажности он может уплотняться [22, 23, 191]. Приготовленное вещество, предварительно
подогретое и тщательно размешанное, наносилось на открытые
полнослойные кожные раны с помощью пипетки.
Хитозан (паспорт № 650) был произведен в РФ ЗАО «Биопрогресс» (Московская область, Щелковский район, п. Биокомбинат, ВНИТИБП). В качестве растворителя использовалось
льняное масло (фирма «Эколен» г. Тверь), зарегистрированное
в МЗ РФ и разрешенное для медицинского применения и промышленного выпуска. Льняное масло изготовлено по защищенной технологии методом холодного прессования с дополнительным введением токоферола. Нормативная документация:
№ ФСП 42–0221–0790–01 Р№ 000379/01–2001 от 12.04.2001.
,
28
2.2. Цитологическое изучение раневого экссудата
Для изучения цитологической характеристики воспалительной
фазы репаративного процесса использовали методику мазковотпечатков, предложенную М.П. Покровской и М.С. Макаровым
[69]. Тщательно промытые предметные стекла замачивались для
обезжиривания в смесь Никифорова. Непосредственно перед
употреблением их обжигали. Подготовленные таким образом стекла осторожно прикладывали параллельно к поверхности раны.
От каждого животного брали по три отпечатка через 6, 12 и 24 часа
после операции. Мазки подсушивались на воздухе, фиксировались
в спиртах и окрашивались по методике Романовского [196].
Мазки-отпечатки изучались под иммерсионной системой
микроскопа «ЛОМО МИКМЕД-1», в 10 полях зрения производился дифференцированный подсчет количества клеток раневого экссудата. Одновременно с помощью окуляр-микрометра
измерялся диаметр их ядер.
2.3. Микроскопическое исследование биопсированного
материала
Для сравнительного анализа микроскопических изменений
при репаративной регенерации кожи у крыс всех серий брались
биоптаты краев раны через 5, 10 и 15 дней после повреждения.
Сроки взятия материала для исследований устанавливались
согласно литературным данным [134, 139, 190, 192, 195]. Животные выводились из эксперимента передозировкой эфирного
наркоза. Из края раны иссекались кусочки с участками неповрежденной кожи. Материал фиксировался в 10% нейтральном
формалине, обезвоживался в спиртовых растворах возрастающей концентрации и ксилоле, заливался в парафиновые блоки.
Срезы толщиной 6–7 мкм, окрашивались гематоксилин-эозином.
Взятие и обработка материала для светооптических исследований осуществлены по общепринятым методикам [196].
29
Гистологические препараты изучались под световым микроскопом «ЛОМО МИКМЕД-1». С помощью окуляр-микрометра
определялась величина новообразованных структур заживающей раны: высота струпа, лейкоцитарного вала, грануляционной
ткани, пограничной зоны эпителия и протяженность эпителиального регенерата.
2.4. Ультраструктурное изучение фибробластов
грануляционной ткани
Для изучения особенностей ультраструктурной организации
фибробластов использовалась новообразованная ткань заживающей раны. Биопсии проводились через 5 и 10 дней после
нанесения дефекта кожи.
Небольшие кусочки ткани с помощью острых ножниц и лезвия брались с поверхности раны и из средних слоев грануляционной ткани на границе раневого дефекта с неповрежденной кожей и немедленно помещались в каплю охлажденного
фиксатора. Префиксация и фиксация осуществлялась в 2,5%
растворе глютарового альдегида на фосфатном буфере рН =
7,2–7,4. Постфиксацию осуществляли в течение трех часов при
температуре 4 °С 1% раствором тетраоксида осмия. Последующее обезвоживание проводилось в этиловых спиртах возрастающей концентрации. Заливка материала осуществлялась в смесь
эпоксидных смол аралдит и эпон. Полимеризация производилась в желатиновых капсулах в течение двух суток в термостате
при 60 °С.
Срезы для электронномикроскопического исследования изготавливались на ультратоме и наносились на медные сеточки.
В качестве подложки использовали формваровую пленку. Контрастирование ультратонких срезов проводилось насыщенным
раствором уранилацетата на 70° спирте. Ультратонкие срезы
изучались с помощью электронных микроскопов УЭВМ-100К
и LVEM 5.
30
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]