Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Регенерация тканей и хитозан
.pdf
2.5. Определение содержания фосфоинозитидов в цельной
крови и грануляционной ткани
Материал для биохимических исследований у крыс всех серий брался до операции и через 5, 10 и 15 дней после нанесения
травмы. Сроки проведения биопсий устанавливались по данным
литературы и соответствовали основным этапам репаративного
процесса [97, 126,135, 136, 139].
Выделение ФИ производилось по разработанной ранее методике [111]. К пробам крови (0,8 мл) и навеске грануляционной
ткани (500 мг) добавляли смесь растворителей хлороформ–метанола (1:1) в объеме 3–5 мкл. Затем фильтровали в мерные пробирки с притертой пробкой объемом 20 мл. Осадок на фильтре
4-кратно, по 0,5 мл, промывали смесью хлороформ-метанола
2:1, содержащей 1% концентрированной НCl по объему. К фильтрату добавляли 0,4 мл 0,02% раствора хлорида кальция, затем
в течение 4–5 минут перемешивали. После четкого расслоения
верхнюю фазу отсасывали и экстракт 4-кратно промывали смесью хлороформ–метанола – 0,02% хлористого кальция в соотношении 3:48:47 [15].
После отмывания липидный экстракт упаривали в токе
азота, предварительно внеся в хлороформную фазу 3 мкл антиоксиданта ионола и растворяли в 50–70 мкл хлороформметанола 2:1.
Исследуемый липидный экстракт наносили на хроматографическую пластинку в виде сплошной узкой полосы на расстоянии
2 см от нижнего края пластинки. Пластинку помещали в плоскую стеклянную камеру для проточной горизонтальной хроматографии [15]. Силикагель марки Л5/40 («Chemapol», Чехия)
наносили на пластинку путем осаждения из разбавленных водных суспензий, содержащих 5% К
а затем слой адсорбента
2СО3,
высушивали на воздухе и активировали в сушильном шкафу при
температуре 120 °С 15 минут.
Выделение фосфолипидов проводили в системе хлороформ–
метанол-7 н. аммиак 13,0:7,0:1,0 [21, 24]. При этом фронт рас-
31
творителя достигал края пластинки через 60 мин, после чего
хроматография продолжалась в условиях протока 15 минут [37].
По окончании хроматографии пластинку высушивали до полного удаления растворителей. Участок сорбента с фракцией
фосфоинозитида (Rf = 0,47) обводили препаравальной иглой
и собирали в пробирку с 10 мл смеси метанол-концентированная
НСl (1:1) при помощи водоструйного насоса.
Собранный силикагель встряхивали с этой смесью растворителей и отстаивали в течение 60 минут. Затем фильтровали, а гель
на фильтре еще 4-кратно промывали в 5 мл этой же смеси. Объединенный элюат упаривали в токе азота, предварительно внеся
в него 5 мкл ионола, растворяли в 20 мкл смеси хлороформ-метанола (2:1) и наносили на хроматографическую пластинку в виде
точек (5–7 мкл). Силикагель наносили на хроматографическую
пластинку путем осаждения из разбавленных водных суспензий,
содержащих 15% раствор углекислого калия. Пластинки активировали в сушильном шкафу при температуре 130 °C 20 минут.
Фракционирование фосфоинозитидов проводили в системе
хлороформ–метанол-7 н аммиак (11,0:4,5:1,0) в течение 90 минут
[72, 77]. При этом фронт растворителя достигал края пластинки
через 70 минут, после чего хроматография продолжалась 20 минут в условиях протока [78]. Параллельно с исследуемыми образцами наносились на пластинку свидетели фосфоинозитидов
фирмы «Sigma» (США). Фракции фосфоинозитидов на хроматограммах располагались в порядке возрастания Rf: ФИ (Rf =
0,18), ФИФ1 (Rf = 0,34), ФИФ (Rf = 0,40), где ФИ – фосфоинозитиды, ФИФ1 – фосфатидилинозит-3-фосфаты, ФИФ –
фосфатидилинозит-4-фосфаты (ФИФ).
Хроматограммы после высушивания сжигались непосредственно над хромовой смесью в специальном эксикаторе, помещенном в сушильный шкаф при температуре 200° С на 40 минут.
Количественное содержание фосфоинозитидов: ФИ, ФИФ1
и ФИФ, определяли денситометрическим методом. Для этих
целей использоавали денситометр «БИАН-170» (Россия), позволяющий анализировать тонкослойные хроматограммы. Перед
32
нанесением исследуемого экстракта, слой силикагеля разделяли
на 12–15 узких полос по 4–5 мм каждая, что обеспечивало одинаковую ширину денситометрируемых пятен, соотвествующих
размеру пучка света прибора. При таких условиях распределение
анализируемого вещества происходило только по ходу растворителя, исключая возможность продольной сорбции. Этот способ
позволяет достаточно точно оценить интенивность окраски пятна фракции и исключить влияние краевых эффектов. Распределение липидного материала в пятне практически обеспечивало
пропорциональность между количеством фракций фосфоинизитидов и площадью их пиков. При этом имелась возможность
в стандартных условиях анализировать на каждой пластинке
одновременно до 15 проб.
Для построения калибровочной кривой использовались
стандартные препараты ФИ, ФИФ и ФИФ1 фирмы «Sigma»
(США), которые наносились на отдельные полосы силикагеля
так, чтобы концентрация липидного фосфора составляла 1, 2,
3, 4, 5, 6, 7, 8 мкг. После хроматографии пластинка проявлялась
над раствором хромовой смеси при t = 200 °C в течение 30 минут,
затем проводилась денситометрия.
По данным денситометрии строились калибровочные кривые.
Фракции фосфоинозитидов определяли в диапазоне концентраций от 0,2 до 8 мкг. Для стандартных фосфоинозитидов чувствительность метода 0,1 мкг, погрешность 5,1 ± 0,1%. После сжигания
проб в парах хромовой смеси исследуемое вещество переносили
в специальные колбочки с 0,5 мл концентрированной азотной кислоты. Определение фосфора проводили по методу Baginski E.S.
et al. [238]. Колориметрирование осуществляли с помощью колориметра-нефелометра КФК-2-УХЛ4 при длине волны 670 нм.
Одновременно с исследуемыми растворами колориметрировали «холостые» пробы, не содержащие фосфора и стандартные
растворы, содержащие 0,1 мкг фосфора. Расчет содержания фосфора осуществляли путем сравнения оптических плотностей
анализируемых и стандартных растворов по формуле для расчета содержания фосфоинозитидов [28].
33
Результаты выражали в нмолях фосфора соответствующего
фосфоинозитида на 1 мг белка. Количество белка определяли
модифицированным методом Лоури [308].
2.6. Статистическая оценка результатов эксперимента
Все количественные результаты экспериментов, полученные
для объективной оценки морфофункциональных изменений
в процессе заживления ран кожи, подвергались статистической
обработке с применением стандартного пакета программ при
помощи Microsoft EXCEL XP (версия 7,0). Данные исследований представлены в виде М ± m, где М – среднее арифметическое, m – стандартное отклонение. Статистическую обработку
полученных результатов исследований проводили методами вариационной статистики, достоверность результатов оценивали
с помощью t-критерия Стьюдента. За достоверные принимали
отличия при уровне вероятности р < 0,05.
Все цифровые материалы оформлены в виде таблиц и графиков с помощью прикладного пакета «Microsoft Graph» в программном продукте «Microsoft Office 2000».
34
Глава 3
Морфофункциональная характеристика
репаративной регенерации кожи
в условиях применения хитозана
3.1. Основные закономерности
репаративной регенерации кожи
Регенерация – это совокупность сложных морфологических
процессов, в которых принимают участие различные ткани [11,
17, 45–51, 84, 115, 134, 198]. Взаимодействие между тканями
различного происхождения – характерная черта процесса заживления ран [67, 89, 162, 181, 195, 196, 198].
Принято различать заживление ран путем первичного натяжения (края раны соприкасаются друг с другом), вторичного
натяжения (рана открыта) и заживление, протекающее под струпом. При заживлении ран первичным натяжением в первые часы
после ранения края раны склеиваются за счет фибрина, выпадающего из излившихся в раневую щель крови, лимфы и экссудата. Через 2–3 часа в прилежащих к ране участках кожи, наряду
с фибринозной экссудацией, начинается миграция лейкоцитов
и мобилизация ретикуло-эндотелиальных клеток, превращающихся в макрофаги, а несколько позже появляются фибробласты. Подавляющее большинство авторов не находит принципиальных различий в характере процессов, наблюдающихся при
заживлении ран первичным и вторичным натяжением [148, 154,
155, 193]. Однако в последнем случае деструктивные явления
выражены обычно сильнее, так как края раны не соприкасаются,
капилляры на поверхности грануляций образуют петли и клубочки петель, а заживление раны требует более продолжительного времени.
Известно, что раневой процесс включает три фазы: воспаление, пролиферацию молодой новообразованной ткани и эпителизацию [56, 59, 61, 86, 116, 119, 125, 136, 196, 216]. Обыч-
35
но фаза воспаления длится около трех дней и характеризуется
присутствием большого количества различных клеточных элементов (нейтрофилов, лимфоцитов, макрофагов), принимающих участие в остром адаптивном ответе организма на повреждение. Первая фаза репаративной регенерации играет важную
роль и представлена двумя взаимосвязанными процессами:
сосудистой и клеточной реакциями. Сосудистая реакция развивается в следующей последовательности: вазоконстрикция,
вазодилатация, увеличение проницаемости сосудистой стенки,
отек, миграция форменных элементов, агрегация клеток крови,
гипостатические явления [114, 160, 163, 180]. Медиаторы воспаления оказывают значительное влияние на появление, развитие
и течение воспаления в ране, посредством воздействия на сосудистую реакцию [197, 213, 214]. Через 4–6 часов после нанесения
повреждения развивается клеточная реакция, которая проявляется в инфильтрации лейкоцитами травмированных тканей [60,
342]. Первыми появляются полиморфноядерные лейкоциты,
затем мигрируют в рану мононуклеарные элементы, макрофаги
и, наконец, фибробласты [80, 301, 343, 349].
Согласно данным литературы функция нейтрофилов при воспалении заключается в том, что они фиксируются к эндотелиальной стенке травмированного сосуда, мигрируют через сосудистую
стенку в ткани, способствуют хемотаксису, обеспечивают фагоцитоз, дегрануляцию и расщепление поглощенного материала [106,
107, 181, 211, 212, 223]. Одновременно под влиянием нейтрофилов стимулируется макрофагальная стадия воспаления, обусловленная выделением клетками хемоаттрактантов (интерлейкины,
фактор некроза опухоли, катионные белки и другие). Макрофаги
контролируют детерминированную программу репаративной регенерации [105, 190] и выделяют такие биологически активные
вещества, как интерлейкин-1, интерфероны, фибронектин и фактор стимуляции фибробластов [187, 339].
Вторая фаза посттравматической регенерации – фаза пролиферации завершается к седьмому-десятому дням и сопровождается резким увеличением количества пролиферирующих
36
фибробластов, продуцирующих коллаген, организацией макромолекул межклеточного вещества соединительной ткани
в волокна и пучки [110, 138, 188], а также образованием сосудов
(ангиогенезом) в грануляционной ткани. Эта стадия репаративной регенерации, по мнению Г.В. Хомулло, выражается в заполнении раневого дефекта вновь образованной тканью [115], которая представляет собой тканевой комплекс (соединительная,
сосудистая и эпителиальная ткани), состоящий из компонентов
различного генеза.
Восстановление соединительной ткани играет ведущую роль
в процессе заживления раны, обеспечивая ликвидацию патологических посттравматических последствий структурного и функционального характера. Определяющее значение в новообразовании соединительной ткани имеет пролиферация и функция
клеток фибробластического ряда [19, 25, 83, 176, 180, 218, 220].
Участие фибробластов в раневом процессе свидетельствует о начале истинно репаративных процессов.
Формирование грануляционной ткани начинается преимущественно по краям раны в виде отдельных участков и в области
дна раневого дефекта. Этот этап представлен активным образованием сосудов, которые врастают в формирующуюся ткань
снизу вверх и на поверхности формируют петли [66], а новообразованная ткань на этой стадии характеризуется полиморфизмом клеточных элементов крови. По мере преобразования
грануляционной ткани в соединительную в ней увеличивается
количество фибробластов, которые характеризуются высокой
синтетической активностью. Они способны синтезировать липиды, углеводы, а также протеины, главным образом, коллаген
[85, 202, 213, 214, 272, 268, 355].
Процесс посттравматической регенерации в коже может
осуществляться различными способами [20, 107, 108]. Особое
значение при заживлении ран кожи имеет контракция, которая,
по мнению Л.Д. Лиознера, Л.А. Браун, Н.А. Красниковой, связана с формированием струпа, синтезом белков и коллагеновых
волокон, изменениями в краевой зоне эпителия и реорганизаци-
37
ей рубцовой ткани [19, 30,87, 154, 207, 208, 240, 250]. Контракцию
краев раны обеспечивает особая группа фибробластов – миофибробласты, напоминающие по строению и свойствам гладкомышечные клетки [182, 186].
Немаловажную роль в процессах сокращения размеров раны
играет вставочный рост [66, 87], который является ответной реакцией на длительное натяжение кожи [70]. Вставочный рост –
это процесс разрастания кожи вокруг раны, направленный
на восполнение утраченной массы кожного покрова. В процесс
его осуществления вовлекается кожа, удаленная на значительное
расстояние от краев раны, площадь которой прямо пропорционально зависит от площади раневого повреждения [8, 192].
Регенерационная гипертрофия, как способ заживления кожных повреждений, наряду с обязательным перемещением кожи
при сокращении раны, происходит на более поздних стадиях
и связана с пролиферацией клеток новообразованного эпителия
[71, 86, 182, 231].
Процессы собственно эпителизации раны протекают путем
мобилизации базальных клеток эпидермиса, их миграции, пролиферации и последующей дифференцировки [20, 55, 179, 240].
Эпителизация кожных раневых дефектов осуществляется только
по молодой новообразованной ткани [139, 194, 197]. Регенерация эпителия начинается с первых дней после нанесения раны.
Ширина каймы нарастающего эпителия обычно не превышает
1–1,5 см, а для полной эпителизации раны необходимо значительное сближение ее краев.
По поводу образования специфических структур кожи (волосяных фолликулов и сальных желез) при заживлении ран
мнения исследователей неоднозначны. Так, согласно данным
Л.Д. Лиознера (1960) и В.А. Ефимова (1987) установлено, что
при спонтанном заживлении раны рубец, возникающий на месте
бывшего повреждения, не может перестроиться в нормальную
кожу. Вместе с тем, в подавляющем большинстве исследований
Г.В. Хомулло, М.Б. Петровой, В.Г. Шестаковой доказано, что
в условиях стимуляции возможно безрубцовое заживление кож-
38
ных ран с формированием утраченных дериватов кожи (волос
и желез) [5, 139, 189, 196, 217].
Таким образом, углубленное знание сущности различных этапов репаративной регенерации кожи позволяет раскрыть механизмы действия новых медикаментозных средств на заживление
ран. Вместе с тем, в связи с изменением реактивности организма
при лечении нарушения целостности кожного покрова искусственно синтезированными средствами, увеличивается количество
аллергических реакций, инфекционно-аллергических и гнойных
осложнений [6, 96]. В этих условиях особое значение приобретает использование в качестве стимуляторов репаративной регенерации кожи препаратов природного происхождения, которые
уменьшают различные побочные эффекты лекарственных средств.
3.2. Влияние хитозана на цитологический состав
раневого экссудата
Цитологический метод исследования является технически
простым, но физиологически дает ценную информацию о клеточных элементах различного (вазогенного и тканевого) происхождения и их состоянии. Он широко применяется в экспериментальных исследованиях и является важным дополнением к клиническим данным, так как позволяет проводить динамическое наблюдение за микроскопическими изменениями в области повреждения,
оценку возникающих осложнений и коррекцию лечения [189].
Цитологическая картина «раневых отпечатков» изменяется
в соответствии со стадиями репаративного процесса. Непосредственно после нанесения повреждения отмечается накопление
нейтрофильных лейкоцитов в период воспаления, затем происходит появление макрофагов, которые регулируют переход
фазы воспаления в стадию развития грануляционно-фиброзной
ткани. В последующем накопление фибробластов обеспечивает
синтез коллагена и основного межуточного вещества на месте
раневого дефекта.
39
В настоящей главе приводятся результаты изучения первой
фазы регенерации – воспалительной реакции у животных, находившихся в различных условиях экспериментального воздействия.
Для изучения цитологической картины раневого отделяемого было использовано 142 белые крысы. Животные делились
на две серии: 1-я – контрольная – животные, на раны которых
ежедневно наносилось вазелиновое масло, 2-я – оперированные
животные, находившиеся в условиях воздействия хитозаном.
Результаты исследования цитологической картины раневого
экссудата показали наличие как качественных, так и количественных различий у животных сравниваемых серий.
Через 6 часов после повреждения у контрольных крыс отмечалась типичная реакция выселения клеточных элементов.
Преобладающее большинство клеток – нейтрофильные лейкоциты нормальной структуры с хорошо сегментированным ядром,
состоящим из 5–6 фрагментов (рис. 1а). В цитограммах животных данной серии встречаются единичные макрофаги (табл. 1).
Таблица 1
Количество (в 10 полях зрения) и диаметр (мкм) клеток
раневого экссудата через 6 часов после операции
Серии М ± m
M
Контроль
Хитозан
Примечание. * – р < 0,05.
m
M
m
Нейтрофилы Макрофаги
Количество Диаметр Количество Диаметр
107,3
19,5
261,2*
17,2
18,2
2,7
19,9
5,7
1,8
0,2
7,1*
1,8
22,5
4,4
29,8
5,6
У крыс, находившихся в условиях воздействия хитозаном,
были обнаружены существенные различия в клеточном составе
раневого отделяемого. Через 6 часов после травмы в отпечатках
животных обнаружено значительное увеличение количества
40
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]