Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Регенерация тканей и хитозан
.pdf
Рис. 22. Расширенные каналы гранулярной цитоплазматической
сети с фиксированными рибосомами и крупные митохондрии
в околоядерной зоне фибробласта. Хитозан. 10 дней. 18 000×
Рис. 23. Множество митохондрий с выраженными и частично
лизированными кристами в цитоплазме активного фибробласта.
Хитозан. 10 дней. 22 000×
71
Рис. 24. Обширные поля правильно ориентированных
коллагеновых волокон в межклеточном пространстве.
Хитозан. 10 дней. 20 000×
Таким образом, результаты исследования тонкой структуры фибробластов новообразованной ткани при заживлении ран
кожи свидетельствуют о том, что в условиях воздействия хитозана происходит значительная перестройка всех внутриклеточных органелл, осуществляющих синтез, накопление и выведение
коллагена в межклеточное пространство.
72
Глава 4
Динамика содержания фосфоинозитидов
на различных этапах заживления ран кожи
в условиях воздействия хитозаном
4.1. Метаболизм фосфоинозитидов и их роль в процессах
посттравматической регенерации
В осуществлении процессов посттравматической регенерации существенная роль принадлежит фосфолипидам и жирным
кислотам, которые входят в состав мембран клеточных структур.
Основная часть липидов (до 90%) в них представлена фосфолипидами, которые определяют основные физико-химические
свойства мембранных структур.
Впервые фосфоинозитиды были выделены из мозга крупного рогатого скота Дж. Фолчем в 1949 году, а затем обнаружены
во всех субклеточных фракциях, причем подавляющее большинство полифосфоинозитидов находится в плазматических
мембранах [4, 37, 78, 168].
Согласно стереоспецифической классификации [111, 225,
242] различают фосфатидилинозиты и их фосфорилированные
формы, которые объединены общим названием фосфоинозитиды
(ФИН). Наиболее распространенным представителем фосфоинозитидов является фосфатидилинозит (ФИ). Значительный
интерес ряда исследователей к фосфорилированным формам
в Д-3, Д-4 позициях инозитольного кольца связан с тем, что при
гидролизе последних образуются активные метаболиты, способные регулировать различные внутриклеточные процессы [96,
107, 111, 141, 147, 347].
В настоящее время существует несколько вариантов метаболизма ФИ, но общепринятой считается схема [224, 311], в которой ключевой реакцией является образование диацилглицеролов
(ДГ) и инозитолтрифосфатов (IP
фатидилинозит-4,5-дифосфатов (ФИДФ) под действием фер-
) вследствие гидролиза фос-
3
73
мента фосфолипазы С. На следующем этапе метаболизма, при
участии фермента диацилглицеролкиназы и АТФ, происходит
образование фосфатидной кислоты. В свою очередь, ДГ и IP
играют роль внутриклеточных посредников [243, 336, 372]. Совокупность реакций метаболизма ФИН или «фосфоинозитидный
ответ» является энерго- и ферментозависимым процессом, а так-
2+
же сопряжен с изменениями концентрации ионов Са
в клетке
[310, 332]. Содержание фосфоинозитидов варьирует от 2 до 10%
от общего содержания фосфолипидов. Отдельные формы фосфоинозитидов отличаются друг от друга жирнокислотным составом
[295], а наиболее распространенными кислотами, входящими
в их состав, являются арахидоновая, стеариновая, олеиновая
и пальмитиновая [281, 282, 357].
Арахидоновая кислота является предшественником целого ряда медиаторов, увеличивает сосудистую проницаемость,
вызывает агрегацию тромбоцитов, обладает хемотаксической
активностью по отношению к нейтрофильным лейкоцитам,
и на ее долю приходится в среднем 14–18% [35, 170, 297, 332].
Метаболизм арахидоновой кислоты осуществляется двумя основными путями. При циклооксигеназной реакции [234] образуется целый ряд физиологически активных веществ, таких как
простагландины (ПГ), в том числе простациклин, и тромбоксаны. В свою очередь, ПГ вызывают вазоконстрикцию, а также
усиливают хемотаксис лейкоцитов. Вместе с тем, они являются
регуляторами сложных процессов на клеточном уровне [295]
и поэтому их называют «клеточными» гормонами. При липооксикиназном пути метаболизма из АК образуются лейкотриены,
которые усиливают хемотаксическое действие на лейкоциты,
увеличивают высвобождение из них лизосомальных ферментов, стимулируют миграцию макрофагов, эозинофилов [296,
299, 305]. Действие образующихся активных меаболитов связано
с действием на рецепторы клеточных мембран, а также способностью непосредственно регулировать активность фосфолипазы
и аденилатциклазы в цитоплазме клеток, которые катализи-
А
2
руют превращение АТФ в циклический аденозинмонофосфат,
3
74
играющего роль «вторичного мессенджера» – универсального
посредника гормонов [321, 329, 335, 337].
Фосфоинозитиды относятся к одной из фосфолипидных
фракций, свойством которых является непосредственное участие
в основных функциях биологических мембран [313, 323, 326].
Учеными обнаружено наличие прямо пропорциональной зависимости между процессами пролиферации клетки и метаболизмом
инозитсодержащих липидов [24, 166, 333]. Изменения фосфолипидного состава ядерных структур и скорости синтеза клеточных
фосфолипидов происходят в результате гормональной индукции
[118], в процессе опухолевого роста [165], эмбриогенеза, постнатального развития животных [118], а также при регенерации
тканей [4, 243, 305].
Плазматические мембраны, обедненные инозитольными липидами вследствие недостатка ФИН, не могут функционировать
нормально [1, 10, 43]. Вместе с тем, фосфоинозитиды, помимо
поддержания структуры мембран, участвуют в активном транспорте ионов, рецепторной функции цитолеммы, присоединении
некоторых ферментов, а также обеспечении арахидоновой кислотой для синтеза простагландинов [167, 303, 311]. Установлено,
что в составе различных форм фосфоинозитидов определяются различные жирнокислотные остатки. На долю аминокислот
в среднем приходится от 14 до 18%, которые являются предшественниками целого ряда медиаторов и регуляторов клеточного
ответа на внешние сигналы (воспалительные, иммунные реакции
и другие).
Известны исследования, доказывающие закономерные изменения липидного состава ядерных структур [4, 10, 24, 164,
165]. Так, усиление синтеза фосфолипидов и количество многих фосфолипидных фракций в ядрах клеток предшествуют или
совпадают по времени с интенсификацией процессов репликации ДНК и транскрипции. Снижение уровня фосфолипидов
в ядерных мембранах и внутриклеточных структурах коррелирует с изменением функциональной активности ядерного генома.
Известно, что липиды клеточных ядер могут принимать участие
75
в процессах считывания генетической информации. Имеются
данные о влиянии фосфолипидов на активность ДНК- и РНКполимеразы [174, 175, 251]. Установлена способность фосфолипидов взаимодействовать с ДНК, а также гистоновыми и негистоновыми белками ядер [305]. В пролиферирующих клетках
скорость обмена фосфоинозитидов по сравнению с покоящимися значительно повышается [294, 295].
Высвобождение фосфата из фосфатидилинозита коррелирует с клеточным ростом [311, 337]. Имеется мнение об участии
инозитсодержащих липидов в переходе к неконтролируемому
росту и трансформации. Считается, что репликация клеток ини-
2+
циируется избытком Са
в цитоплазме, а неопластические клет-
ки пролиферируют автономно потому, что их плазматические
2+
мембраны пропускают излишние количества Са
или их мито-
хондрии оказываются не в состоянии хранить депонированный
2+
[14, 311, 314].
Са
На ранних стадиях репаративной регенерации R.V. Farese,
S.P. Kent (1984) установили усиленный выход липопротеинов
во внесосудистое пространство, а затем разрушение липидов
мембран и других структур клетки. При этом общая концентрация фосфолипидов в раневом эксcудате на протяжении первых
трех дней составляет около 34% по сравнению с плазмой крови,
а уровень фосфатидилсерина и фосфатидилинозита снижается
почти в 30 раз [281].
В работах К.Г. Карагезяна, Л.М. Овсеняна, К.Г. Адонца (1990)
достаточно полно изучено влияние фосфолипидов на некоторые
показатели системы гемостаза [15, 24]. Метаболиты фосфолипидов такие, как фосфатидилсерин, вызывают усиление антикоагулянтного эффекта, замедляют время свертывания крови,
уменьшают содержания фибриногена и повышают фибринолитическую активность.
Фосфатидилинозитфосфаты являются минорными фосфолипидами клеточных мембран. На их долю приходится не более 6%
от общего количества фосфолипидов [24, 44]. Однако тот факт,
что они имеют четкую функциональную и структурную связь
76
с интегральными белками клеточной мембраны, позволяет рассматривать их как один из самых важных элементов в трансмембранной передаче сигналов [248, 337]. В покоящихся клетках
основными компонентами фосфатидилинозитолов являются
два фосфорилированных метаболита: фосфатидилинозит-4-фосфаты (ФИФ) и фосфатидилинозит-4,5-дифосфаты (ФИДФ).
2+
При стимуляции Са
-мобилизирующих рецепторов происходит
активация мембран-ассоциированной фосфолипазы С, которая
гидролизует ФИДФ на инозитолтрифосфат и диацилглицерол.
Эти два метаболита являются вторичными мессенджерами, передающими сигнал с рецептора клетки на ядро. Инозитолтри-
2+
фосфат высвобождает Са
из немитохондриальной фракции
внутриклеточных депо [338]. Диацилглицерол в присутствии
ионов кальция активирует протеинкиназу С, фосфорилирующую белки для активации генома [251, 327].
В исследованиях А.А. Вишневского, Э.Я. Янгалычева,
В.М. Яковлева (1995); Э.С. Геворкяна, Ж.В. Яворяна, И.Г. Арцруни (1995) сообщается об изменениях скорости реагирования
уровня содержания фосфолипидов на различные стимулирующие агенты [27, 35, 117]. Под действием холинэргических и адренэргических веществ возрастает скорость включения неорганического фосфата в монофосфоинозитид и фосфатидную кислоту
различных тканей.
Сведения о влиянии нейромедиаторов на обмен ди- и трифосфоинозитидов противоречивы. Так, при действии ацетилхолина
на нервную ткань экспериментальных животных одни исследователи не находили изменений в обмене полифосфоинозитидов
[288], другие [289, 292] обнаружили снижение, третьи – повышение скорости включения фосфата в них [294, 347].
Доказано, что изменение количества фосфолипидов в ответ на различные воздействия происходит в течение нескольких секунд и тесно связано с транспортом ионов, метаболитов,
рецепторной и энергетической функциями клетки [120, 292].
Об интеграции регуляторных систем у всех клеток на мембранно-цитоплазматическом уровне свидетельствует тот факт, что
77
мессенджеры совпадают у различных видов рецепторов, что
обуславливает возможность поиска лекарственных препаратов,
влияющих на эти системы.
Самостоятельный интерес представляют результаты изучения
влияния различных факторов на содержание ФИ в процессе заживления экспериментальных ран кожи [68, 145, 217].
В исследованиях Петровой М.Б. (1993) показано, что при
облучении раневой поверхности низкоинтенсивным лазером
наиболее выраженным изменениям подвергается фракция сфингомиелинов фосфолипидного компонента мембран. Уменьшение
процентного содержания лизофосфолипидов в мембранах отмечалось на ранних этапах воздействия. При этом процентное
содержание диацильных форм (фосфоатидилхолинов, фосфатидилэтаноламинов и фосфатидилинозитов) существенно не изменялось. Вместе с тем, имеются данные о том, что при облучении
лазером происходят изменения не только основного фосфоинозитида, но и его фосфорилированных форм – ФИФ, ФИФ1,
ФИДФ [139, 329].
Шестакова В.Г. (1996) в серии экспериментов установила,
что при воздействии на различные точки электроакупунктуры
наблюдаются разнонаправленные изменения содержания фосфоинозитидов в эритроцитах, лимфоцитах, макрофагах крови
и грануляционной ткани. В этих условиях наибольшим изменениям подвергается фракция сфингомиелинов фосфолипидного
компонента мембран. Выявлено повышение некоторых продуктов метаболизма фосфолипидов – арахидоновой кислоты
и диацилглицеролов в крови на начальных этапах заживления
в среднем в 1,3 раза по сравнению с последующими сроками регенерации ран кожи. Отмечаются существенные изменения динамики лизофосфолипидов, что проявляется в резком уменьшении
их процентного содержания в мембранах, особенно на начальных
этапах воздействия [217].
Изменения содержания ФИ и их фосфорилированных форм
изучались в дальнейшем Харитоновой Е.А. (1997) при заживлении экспериментальных ран кожи у крыс. Автор установила,
78
что в условиях применения гиалуроновой кислоты на начальных
этапах регенерации асептических и инфицированных ран кожи
происходит повышение количества полифосфоинозитидов,
а уровень содержания фосфоинозитидов и уровень вторичных
мессенджеров – диацилглицеролов восстанавливается до исходных показателей через 15 дней после нанесения повреждений
[145].
Данные, приведенные выше, убедительно показывают, что
инозитсодержащие липиды принимают непосредственное участие в осуществлении различных этапов репаративной регенерации кожи. Однако работ по исследованию динамики содержания
ФИ и их фосфорилированных форм в крови и грануляционной
ткани при заживлении полнослойных ран кожи в условиях применения хитозана нами не обнаружено.
4.2. Изучение динамики фосфоинозитидов в цельной крови
на различных этапах посттравматической регенерации
кожи при применении хитозана
В настоящей главе представлены результаты исследований
динамики содержания фосфатидилинозитов (ФИ) и их фосфорилированных форм фосфатидилинозит-3-фосфатов (ФИФ1)
и фосфатидилинозит-4-фосфатов (ФИФ) в цельной крови
и грануляционной ткани в процессе заживления полнослойных
ран кожи в результате применения хитозана. Эксперименты выполнены на 134 белых крысах, которые были разделены на три
серии: 1-я – интактная – животным травму не наносили, 2-я –
контрольная – раны животных смазывали вазелиновым маслом,
3-я – животные, на раны которых ежедневно наносили хитозан.
Исследование содержания биохимических показателей в цельной крови и грануляционной ткани проводилось в динамике:
до операции и в различные сроки после нанесения травмы. Для
этого взятие материала (навеска грануляционной ткани 500 мг)
и 1 мл крови осуществляли через 5, 10 и 15 дней после операции.
79
Установлено, что количество фосфатидилинозитов (ФИ)
в цельной крови у животных контрольной серии через 5 дней
после операции в среднем в 1,22 раза выше их значений у интактных крыс (табл. 7). На последующих этапах заживления отмечалось повышение уровня содержания ФИ. Так, через 10 и 15 дней
от начала наблюдения количество фосфатидилинозитов у крыс
контрольной серии было соответственно в 1,4 и 1,6 раза выше,
чем у неоперированных животных.
Таблица 7
Содержание фосфатидилинозитов (ФИ) в цельной
крови (нмоль фосфора ФИ на 1 мг белка) до операции
и на различных этапах заживления ран
Серии М ± m 5 дней 10 дней 15 дней
Интактная
Контроль
Хитозан
Примечание. * – р < 0,05.
М
m
М
m
М
m
5,0
0,2
6,1*
0,1
10,1*
0,1
5,0
0,2
7,2*
0,2
7,9*
0,14
5,0
0,2
8,2*
0,1
5,3*
0,13
Одновременно нами выявлено, что соотношение фосфорилированных форм ФИФ1/ФИФ в цельной крови у животных
контрольной серии изменялось на различных этапах заживления ран кожи и составляло 0,12:0,05 через 5 дней; 0,13:0,08 через
10 дней; 0,19:0,39 через 15 дней после нанесения травмы.
В условиях применения хитозана нами получены несколько
иные биохимические показатели содержания ФИ и их фосфорилированных форм в цельной крови при заживлении ран кожи
у животных.
Количество ФИ в цельной крови через 5 дней после операции
у крыс этой серии в среднем в 2,02 раза выше их значений у неоперированных животных. Изменение содержания ФИ в цельной
крови у оперированных животных сопровождались отчетливыми
80
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]