Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Регенерация тканей и хитозан
.pdf
воздействии хитозаном свидетельствуют о существенных различиях в процессе заживления асептических полнослойных ран
кожи у животных сравниваемых серий.
При макроскопическом изучении области раневого повреждения нами установлено, что в условиях применения хитозана воспалительная реакция выражена значительно слабее, а ровный,
гладкий формирующийся струп плотно прилегает к раневой поверхности. Через 2–3 дня у животной данной серии отмечается
бурное развитие грануляционной ткани ярко-розового цвета,
заполняющей весь дефект. У крыс, на раны которым применяли хитозан, отмечается более быстрое уменьшение площади открытой раневой поверхности (через 10 дней после нанесения
2
повреждения 27,2 ± 1,2 мм
против 68,1 ± 3,3 мм 2 в контроле),
что проявляется в сокращении общих сроков заживления у животных на 3 дня. Результаты наших исследований подтверждаются работами P. Drenda et al. (1997), которые отмечали при
использовании хитозана сокращение сроков заживления ран
на 48 часов по сравнению с контрольной группой [275], а также
гемостатический эффект вещества [26, 280].
В соответствии с данными макроскопического исследования
заживления ран находятся и результаты цитологического изучения раневого экссудата при использовании хитозана. В этих
условиях нами отмечено ускорение течения воспалительной реакции, которое связано с усилением миграции клеточных элементов
в очаг повреждения. Полученные результаты подтверждаются
количественными показателями содержания нейтрофильных лейкоцитов в мазках-отпечатках через 6 и 12 часов после нанесения
раны. Максимальное накопление нейтрофилов в очаге воспаления
отмечалось через 12 часов по сравнению с животными контрольной серии (354,6 ± 18,3 в 10 полях зрения против 299,7 ± 17,4
в контроле). Нейтрофилы, как известно [44, 62, 125, 199–201, 205,
239, 254], выделяют комплекс биологически активных веществ,
которые создают благоприятные условия для хемотаксиса, дифференцировки макрофагов и усиления их активности. Наши результаты подтверждаются исследованиями V. Yu. Nikitin et al. (1994),
91
Ueno H. et al. (2001), которые отмечают, что применение хитозана
усиливает миграцию и увеличивает функциональную активность
нейтрофилов при изучении воспалительного процесса в ране.
Наибольшего развития у животных, на раны которых наносили хитозан, достигает макрофагическая фаза воспаления.
Этот факт подтверждается присутствием большого количества
макрофагов в очаге воспаления на протяжении всего периода
наблюдения и их высокой фагоцитарной активностью. Макрофаги в раневом отделяемом у животных данной серии характеризуются более крупными, чем в контроле, размерами и ядрами с рыхлым хроматином. Цитоплазма этих клеток заполнена
большим количеством пищеварительных вакуолей. Макрофаги,
выделяя интерлейкин-1, в свою очередь, усиливают активность
полиморфноядерных лейкоцитов, увеличивая адгезию, хемотаксис, фагоцитоз и продукцию свободных форм кислорода [161,
182, 214, 282, 309]. Кроме этого, макрофаги выделяют медиаторы иммунной системы (интерлейкин-1 и 8, интерфероны, колониестимулирующий фактор), которые стимулируют дифференцировку фибробластов [259, 366]. Подтверждением наших
данных являются исследования G. Peluso et al. (1994), M. Kweon
et al. (2003), которые свидетельствуют о том, что использование
хитозана приводит к усилению активности макрофагов [358]
и активированию фагоцитоза [232, 304].
Известно, что макрофаги выполняют в зоне повреждения более сложные функции, чем другие клеточные элементы экссудата – они контролируют генетически детерминированную программу репаративной регенерации, так как секреторные эффекты
макрофагов отличаются широтой биологического потенциала.
Они вырабатывают особый фактор стимуляции фибробластов,
интерлейкины, простагландины, фибронектин, интерфероны
и другие вещества. В то же время макрофаги служат источником коллагеназы, обеспечивая ремоделирование соединительной
ткани [432]. Макрофаги выделяют медиаторы иммунного ответа
(интерлейкин-1, стимулирующий Т-хелперы) и осуществляют
элиминацию антигена [3, 112].
92
Оценивая в целом течение первой фазы репаративного процесса, следует отметить, что хитозан ускоряет течение воспалительной реакции, в результате чего сокращается продолжительность и изменяется ее характер. Одновременно осуществляется
резорбция поврежденной ткани в области травмы, определяя
темпы формирования и сроки созревания грануляционной ткани. Полученные нами результаты позволяют утверждать, что хитозан обладает выраженным противовоспалительным действием,
на что указывают и другие авторы [39–41, 263, 356].
Эти эффекты находятся в полном соответствии с биохимическими показателями липидного обмена в цельной крови
и регенерирующей ткани. Так, содержание основного фосфоинозитида – ФИ в крови у животных, находившихся в условиях
применения хитозана, на начальных этапах заживления имело четкую тенденцию к увеличению показателей. Их значения
в 1,7 и 1,2 раза больше, чем в контроле, что, вероятно связано
с тем, что эти соединения являются естественными активаторами клеточных элементов, участвующих в репаративных процессах [102]. Во время воспалительной фазы заживления ран кожи
отмечено увеличение ФИФ1, в то время как значение ФИФ
в 1,7 раза ниже, чем в контроле. Изменения процессов взаимопревращения фосфоинозитидов в сторону образования их фосфолирированных форм в Д-3 позиции инозитольного кольца
ФИ сопровождается усилением процессов гидролиза. В результате этого могут образовываться вторичные мессенджеры IP
3
которые, как известно [6] направлены на активацию клеточных
элементов и регуляцию пролиферации. Фосфоинозит-3-фосфат
и фосфоинозит-4-фосфат обладают особым характером действия и способны усиливать функциональную активность клеток
крови. Этот факт может свидетельствовать об активизации клеточных элементов, участвующих в осуществлении первой фазы
репаративной регенерации – воспалении.
Проведенные нами морфологические исследования показали, что формирующаяся под влиянием хитозана грануляционная ткань характеризуется особыми изменениями со сторо-
,
93
ны микроциркуляторного русла, что выражается усилением
процессов ангиогенеза и согласуется с данными L. Wang et al.
[317, 318].
Спорным является вопрос о роли хитозана в образовании новых сосудов. По мнению некоторых исследователей [276] хитозан препятствует развитию сосудов в ткани. Наши исследования,
напротив, показывают, что при использовании хитозана грануляционная ткань характеризуется мощным развитием сосудов, что
находит подтверждение в работах и других авторов [277, 328].
Известно, что процессы ангиогенеза и миграции нейтрофилов
при использовании хитозана происходят благодаря повышенному выделению интерлейкина-8 из фибробластов [253, 260]. Нами
показано, что слой вертикально ориентированных капилляров
формируется уже на начальных этапах образования грануляций. Грануляционная ткань является выражением единства воспаления и пролиферации – неразрывных компонентов единой
тканевой реакции на повреждение [45–47, 52–54, 163, 165, 191].
Активное очищение раны от микроорганизмов и некротизированных масс способствует раннему созреванию фибробластов
и повышению их функциональной активности. Новообразованная ткань в условиях применения хитозана характеризуется
полиморфизмом клеточных элементов различного генеза, среди
которых преобладающими являются фибробласты. Причем, основную массу составляют молодые и высокодифференцированные клетки, что подтверждают данные изучения их ультраструктурной организации.
Роль фибробластов в репаративной регенерации реализуется
через продукты их специфической секреции: коллаген, эластин,
протеогликаны и гликопротеины [57–58, 138, 139, 143]. Коллагеновые волокна являются опорным каркасом для регенерирующего эпителия. Гликозаминогликаны и гликопротеины играют
роль в осуществлении трофической функции формирующейся
соединительной ткани, заключающейся в регуляции водно-солевого равновесия, транспорта ими веществ, обмена гормонов,
витаминов и других биологически активных веществ. Протеог-
94
ликаны оказывают существенное влияние на размножение клеток, в том числе и эпителиальных [75, 108, 137, 182].
В период формирования грануляционной ткани нами обнаружены существенные изменения в ней фосфоинозитидного
обмена по сравнению с животными контрольной серии. При
изучении биохимических показателей в грануляционной ткани
через 5 и 10 дней после операции нами отмечено, что содержание ФИ было в среднем в 1,2 раза ниже их уровня у животных
контрольной серии, что, по-видимому, свидетельствует о завершении резорбции избыточной ткани и формировании молодой
соединительной ткани. Причем, через 5 дней после операции
у животных, находившихся в условиях использования хитозана,
содержание ФИФ1 в новообразованной ткани было в среднем
в 1,5 раза выше по сравнению с контрольными показателями.
Вместе с тем, содержание ФИФ в грануляциях в этот же период составляло в среднем в 1,5 раза выше их уровня у животных
контрольной серии. Обращает на себя внимание тот факт, что
соотношение ФИФ1/ ФИФ через 5 и 10 дней после воздействия
хитозаном составило в среднем 3,9: 5,1 и 3,6: 4,1 соответственно,
тогда как в контроле это соотношение было 2,7: 3,5 и 2,1: 3,6.
Полученные данные динамики изменения фосфорилированных
форм ФИ в этот срок позволяют предположить, что в процессе
фосфорилирования активируются ферментные системы (фосфатидилинозиткиназы). В результате фосфорилирование ФИ приводит к образованию ФИФ1, ФИФ, при гидролизе которых образуются инозитол-1,3,4-трифосфат, способный непосредственно действовать как вторичный мессенджер на различные типы
клеток [72]. Вместе с тем, активирование фосфатидилинозит-3киназы стимулирует клеточный рост. Кроме того, имеются данные, что ФИФ1 может быть фактором в передаче митогенных
сигналов [165]. По мере созревания грануляционной ткани происходит редукция капилляров, и выраженный слой составляют
горизонтально ориентированные фибробласты.
Раннее развитие и созревание соединительной ткани, усиление процессов коллагенообразования, приводит к формиро-
95
ванию гладкого, нежного рубца, не выступающего над поверхностью кожи. В условиях применения хитозана изменяются
и способы регенерации. Одновременно с пролиферацией и быстрым развитием сединительнотканных компонентов регенерата значительно усиливается контракция раны, обусловленная
активным развитием и функционированием миофибробластов.
Ускоренное формирование грануляционной ткани и трансформация ее в соединительную под влиянием хитозана стимулируют в дальнейшем эпителизацию раневого дефекта. На границе с повреждением эпителий значительно гипертрофируется
(197,4 ± 14,3 мкм против 131,4 ± 12,7 мкм в контроле через 5 дней
после операции), а протяженность эпителиального регенерата
в этот срок в 1,7 раза превышает соответствующий показатель
в контроле. Нами впервые показано, что при использовании хитозана формируется дифференцированный на слои эпителиальный пласт. Базальная мембрана неровная, образует различной
длины и толщины выросты в подлежащую ткань, в которой формируются волосяные фолликулы и сальные железы, что приводит к развитию органоспецифичного регенерата.
На стадии эпителизации ран количество ФИ у животных
достигает исходных значений, что, вероятно, связано с восстановлением целостности мембранных структур клеток и увеличением активности ферментов фосфорилирования – фосфатидилинозиткиназы [72]. Подтверждением полученных нами
данных являются исследования других авторов [189, 217], которые в условиях применения электропунктуры и гиалуроновой
кислоты отмечают аналогичную тенденцию в динамике ФИ и их
фосфорилированных форм, что доказывает влияние процессов
фосфорилирования и гидролиза ФИН на течение репаративной
регенерации.
При исследовании ультраструктурных изменений фибробластов грануляционной ткани нами выделялись три вида клеток:
молодые, зрелые фибробласты и фиброциты. Электронномикроскопические исследования грануляционной ткани животных,
которым применяли хитозан, позволили установить определен-
96
ные структурно-функциональные особенности клеток фибробластического ряда. Эти отличия проявляются в гипертрофии
ядра и ядрышка, гиперплазии канальцев цитоплазматического
ретикулума, увеличении количества фиксированных рибосом,
количества и размеров митохондрий, наличии хорошо развитых
компонентов пластинчатого комплекса. Приведенные выше особенности фибробластов свидетельствуют об усилении процессов
коллагенообразования [8, 70, 149, 157–161, 203–204, 206, 209].
Ультраструктурные исследования фибробластов, проведенные нами, показали, что под воздействием хитозана происходит
усиленное развитие гранулярного ретикулума, который является
материальной основой для их активной синтетической деятельности. Гораздо чаще, чем в контроле, рибосомы обнаруживаются
в виде больших агрегатов. Известно, что именно такие рибосомы
активнее включают аминокислоты и синтезируют белок [70].
Кроме того, в фибробластах гипертрофируется пластинчатый
комплекс, в котором происходит накопление веществ, образованных на рибосомах цитоплазматического ретикулума, и их
последующее выделение из клетки.
О повышенной секреторной деятельности фибробластов
свидетельствуют изменения и других субмикроскопических
структур. При исследовании митохондрий нами отмечалось увеличение их общего количества и размеров. Число крист в них
возрастает по сравнению с контролем, а матрикс характеризуется
высокой электроннооптической плотностью.
Усиленная по сравнению с контролем продукция и экскреция
фибробластами под влиянием хитозана коллагенового белка,
сопровождается его ускоренной трансформацией в волокна. Как
показали наши исследования, в новообразованной ткани крыс,
на раны которых наносился хитозан, обнаруживаются пучки зрелых коллагеновых волокон с характерной поперечной исчерченностью. Причем, соединительнотканные волокна оказываются
окруженными гелеобразной субстанцией, которая выполняет
одновременно две функции: с одной стороны объединяет волокнистые элементы и, в то же время, изолирует их друг от друга.
97
Эти данные позволяют нам утверждать, что одним из процессов,
лежащих в основе стимулирующего эффекта хитозана, является
усиление фибробластами процессов коллагеногенеза, что подтверждается и другими авторами [64, 81, 298, 347, 366].
Приведенные результаты позволяют нам связать внутриклеточные перестройки фибробластов не только с усилением
коллагеногенеза, но и образованием ФИ в цитоплазматическом
ретикулуме и других мембранных структурах и их фосфорилированием в присутствии киназы до метаболитов. Необходимо
также отметить, что изменения обмена ФИ и их фосфорилированных форм в цельной крови характеризуют репаративный процесс не только как локальную реакцию на повреждение, но и как
комплекс сложнейших процессов, осуществляющихся на уровне
организма.
Полученные результаты экспериментальных исследований
предполагают целесообразность проведения дальнейших исследований 1% суспензии хитозана на льняном масле на предмет
создания нового лекарственного вещества – природного стимулятора заживления асептических полнослойных ран кожи.
98
Литература
1. Ажгихин, И.С. Биоформация и простагландины / И.С. Ажгихин, Ган-
дель В.Г. // Некоторые проблемы биоформации и фармакокинетики / Под ред. И.С. Ажгихина. – М.: [б. и.], 1972. – Гл. 5. – С. 138–141.
2. Аксенова, В.И., Шарипова, М.М., Извольская, М.С., Вороно-
ва, С.Н., Мельникова, В.И. Репаративная регенерация тканей кожи
крыс под действием растительных препаратов // Вестник восстановительной медицины. – 2011. № 3. – С. 21–24.
3. Албулов, А.И., Самуйленко, А.Я., Еремец, В.И., Фролова, М.А.,
Шинкарев, С.М., Фоменко, A.C., Авдиенко, И.Д., Герасименко, Д.В., Немцев, C.B., Варламов, В.П. Перспективы применения
низкомолекулярных хитозанов в производстве БАД // Материалы
5-й Международной научной конф. «Фитотерапия, биологически
активные вещества естественного происхождения». – Черноголовка. – 2004. – С. 312–317.
4. Алексеенко, А.В. Структурно-функциональные аспекты репли-
кации и репарации ДНК / А.В. Алексеенко. – Пущино.: [б. и.],
1983. – 86 с. – Библиогр.: с. 84–85.
5. Алексеева, Н.Т., Никитюк, Д.Б., Глухов, А.А. Морфологическая
оценка отдаленных результатов регенерации кожи в экспериментальных ранах после светотерапии // Международный журнал
экспериментального образования. – 2012. № 5. – С. 30–31.
6. Аллергия / Под ред. В.А. Адо, Л.А. Горячкиной, Д.Н. Маянского. –
Новосибирск: [б.и], 1981. – 112 с.
7. Арзыматов, Р.К. Экспериментальные обоснования клинического
применения хитозанового геля при лечении закрытых переломов
костей голени: Автореф. дис. … канд. мед. наук: 14.00. 15.:14.00.22 /
Арзыматов Руслан Кемелович; [Новосибирск. мед. инст.]. – Новосибирск, 2005. – 169 с. – Библиогр.: с. 145–168.
8. Аспиз, М.Е. О регенерации кожных желез и волос у некоторых
млекопитающих / М.Е. Аспиз // Труды Института морфологии
животных. – 1954. – № 11. – С. 35–37.
9. Бабак, В.Г. Коллоидные свойства производных хитина и хитоза-
на. Теория и практическое применение / В.Г. Бабак // Под ред.
К.Г. Скрябина, Г.А. Вихоревой, В.П. Варламова. – М.: Наука,
2002. – Гл. 4. – С. 201–214.
99
10. Бабенко, Н.А. Направленное изменение жирнокислотного спектра
липидов ядерных структур и функциональное состояние клеточного генома / Н.А. Бабенко // Укр. биохим. журн. – 1986. – Т. 58,
№ 3. – С. 40–47.
11. Банин, В.В. Роль перицитов в механизме новообразования сосудов
регенерирующей соединительной ткани / В.В. Банин // Морфология. –2004. – Т. 125, № 1. – С. 45–50.
12. Белоусов, А.А., Лукаш, В.А., Мещанинов, В.Н., Нифонтова, А.А.,
Щербаков, Д.Л. Влияние нейрометаболитов на активность каталазы у крыс разного возраста в норме и при иммобилизационном
стрессе [Текст] //Актуальные вопросы современной медицинской
науки и здравоохранения: Материалы 55 научной конференции
студентов и молодых ученых. – Екатеринбург, 2000. – С. 44–45.
13. Березовская, И.В. Классификация химических веществ по пара-
метрам острой токсичности при парентеральных способах введения / И.В. Березовская // Химико-фармацевтический журнал. –
2003. – Т. 37, № 3. – С. 32–34.
14. Берридж, М.Д. Молекулярные основы внутриклеточной коммуни-
кации / М.Д. Берридж // В мире науки. – 1985. – № 12. – С. 98–99.
15. Биологические мембраны / под ред. Дж. Финдлея, У. Эванза,
А.Д. Виноградова. – М.: Мир, 1990. – 424 с.
16. Богданов, В.Д. Структурообразователи и рыбные композиции /
В.Д. Богданов, Т.М. Сафронова. – М.: ВНИРО, 1993. – 177 с. –
Библиогр.: с. 173–176.
17. Божков А.И., Малеев В.А. Снижается ли способность печени к ре-
генерации с возрастом – динамика функциональной активности
митохондрий в процессе регенерации печени // Успехи геронтологии. – 2004. № 13. – С. 58–65.
18. Большаков, И.Н. Использование хитозана и его продуктов при
воспалительных заболеваниях желудочно-кишечного тракта /
И.Н. Большаков, С.Н. Насибов, Е.Ю. Куклин, А.А. Приходько //
Под ред. К.Г. Скрябина, Г.А. Вихоревой, В.П. Варламова. – М.: Наука, 2002. – Гл. 6. – С. 280–298.
19. Браун, Л.А. О полноте восстановления кожи при ее посттравма-
тической регенерации у теплокровных животных / Л.А. Браун,
Е.А. Ефимов // Бюлл. эксп. биол. и мед. – 1971. – Т. 71, № 3. –
С. 82–86.
100
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]