Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Балантидиоз свиней (совершенствование методов лечения и профилактики). Монография
.pdf
ного приспособления (кювета с «П»-образной рамкой) и выбивали различные фазы трутней в кювету. За 2–3 секунды практически все фазы имеющиеся на рамке попадали в кювету (200–300
экземпляров). Пять-десять личинок из 100 все же оставались в
ячейках.
III способ. Рамку с расплодом держали в левой руке, опирая
ее на кювет, а
правой рукой собирали фазы трутней с помощью
автомобильного пылесоса со специальной насадкой и пластмассовой ёмкостью или выбивали различные фазы трутней в кювет.
В ячейках не оставался расплод и за 20 секунд собирали 200–300
экземпляров. В дальнейшем весь материал с помощью ножа или
ложки помещали в пластмассовые емкости по 50–500 мл. С целью
сохранения полученного биологического материала в условиях
летней жары и отсутствия холодильных камер на пасеках добавляли 0,5 % карболовую кислоту из расчета одна капля на 1 мл или
40 % раствором спирта (одна часть спирта на девять частей сбора)
и транспортировали.
Анализируя полученные результаты, следует отметить, что II и
III способ получения личинок пчел наиболее эффективны и
могут
быть использованы для получения этого биологического материала в условиях пасеки. Вторым компонентом кормовой добавки был
подмор пчёл. «Подмор» – это погибшие пчелы, собранные в разные сезоны года. Мы в своих исследованиях использовали подмор,
собранный в весенний период, то есть пчелы, погибшие в зимний
период времени.
Подмор очищали от
механических примесей, плесени, воска,
прополиса. Высушивали, собирая его в матерчатые сумки и хранили на открытом воздухе или собирали в целлофановые мешочки и
хранили в холодильнике при температуре –4 °С. Собранный материал измельчали на мясорубке с размером сетки 3 мм и.использовали
в дальнейшей работе. При этом было отмечено, что лучше сохра
няется подмор при хранении в морозилке бытового холодильника,
так как в высохшем подморе пчел развивались все фазы восковой
моли, которые уничтожали подмор.
-
9.3.2. Разработка состава кормовой добавки
Привезенный с пасеки материал из личинок трутней в ла-
боратории подвергался дальнейшей обработке: его измельчали на
81
мясорубке, в гомогенизаторе шуттелировали со стеклянным стерильным песком или обрабатывали ультразвуком.
I способ. Личинки измельчали на мясорубке до консистенции
густой сметаны (с включениями до 3 мм в диаметре). Продолжительность измельчения 1 кг материала – 10 минут. В качестве стабилизирующей среды добавляли 5 %-ную глюкозу из расчета: одна
часть материала и девять частей 5 %-ной
глюкозы.
II способ. Материал обрабатывали вначале на мясорубке, а затем на гомогенезаторе в течение 7 минут, при скорости 2 тыс. об/
мин до сметанообразной консистенции (с включениями 1–1,5 мм в
диаметре). Продолжительность обработки – 45 минут.
III способ. Материал пропускали через мясорубку обрабатывали на гомогенезаторе MPW 303 в течение 12 минут при 3 тыс. об/
мин. и
шуттеллировали с нейтральным стеклянным песком в 0,5
литровых колбах течение 3 часов. Для предотвращения развития
микрофлоры на 1 литр материала добавляли 30 мг ампицилина.
Затем отстаивали в холодильнике в течение 1 часа. Надосадочную
жидкость сливали в другую посуду. Продолжительность обработки материала 6 часов. Материал имел жидкую сметанообразную
консистенцию (с включениями от 0,8 до 1 мм в диаметре).
способ. Личинки пчел, привезенные с пасек замораживали
IV
при температуре – 4–5°С в течение 12–24 часов, затем размораживали в течение 5–10 мин до + 40 °С, гомогенизировали на MPW
303 в течение пяти минут при 3 тыс. об/мин и подвергали обработке ультразвуком на УЗДН-1 при максимальной мощности 400 Вт,
силе тока 0,7А и частоте 35 с экспозицией пять
минут. В качестве
стабилизирующей среды использовали 5%-ный раствор глюкозы
(одна часть гомогената и девять частей глюкозы).
На изготовление биологического материала из трутней уходило
от 12 до 24 часов. Биологический материал был сметанообразной
консистенции без видимых включений, то есть размер частиц был
меньше 0,8 мм.
Таким образом, при обработке полученного материала различными способами
установлено, что последний, IV способ, обработки способствует получению биологического материала более
мелкой дисперсности, чем предыдущие и наиболее приемлем для
дальнейшей работы, поэтому нами использовался в работе IV способ обработки полученного материала.
82
9.3.3. Разработка состава и способов приготовления
кормовой добавки из личинок трутней
и подмора пчел
Проводя патентный поиск и анализируя данные литературных источников, мы отметили, что ученые крайне редко описывали применение продуктов пчеловодства в качестве лекарственных
средств и биологически активных добавок для животных.
И. И. Тетерев и другие использовали 20 %-ный спиртовый экстракт прополиса; С. А. Позов и другие применяли прополис для
лечения бронхопневмонии
. Использование трутневого расплода
пчел для подобных целей не описывается, хотя их состав уникален
(Прохода И. А., 2006). Поэтому целью нашей работы являлось создание эффективного безотходного способа приготовления кормовой добавки из личинок трутней и подмора пчел для ветеринарии.
При разработке новой кормовой добавки нами были подобра-
ны аналоги и прототипы
. При этом было выявлено, что известен
способ получения лечебно-профилактического продукта из перги,
включающий помещение сырья в герметичную камеру, снижение
давления в ней до 100 мм.рт.ст. с последующей обработкой сырья
в камере с помощью СВЧ-поля. При этом СВЧ-нагрев проводят таким образом, чтобы температура в камере не
превышала 45 °С до
получения целевого продукта с влажностью не более 5 %. Полученный продукт имеет повышенное содержание витаминов, незаменимых аминокислот, микроэлементов, а также способность при
длительном хранении сохранять свои целебные свойства.
Недостатком данного способа является его высокая стоимость,
сложность получения.
Известен способ фракционирования прополиса, включающий
экстракцию прополиса, при этом в качестве
исходного материала
используют измельченный прополис или запрополисованные холстинки. Экстракцию проводят в две стадии: экстрагируют сжиженной углекислотой при давлении 6,0–7,0 МПа в течение 3–5 ч при
температуре 22–26 °С с выделением углекислотного экстракта; на
второй стадии углекислотный экстракт обрабатывают 70–94 %-ным
раствором этилового спирта при температуре 25–60 °С в течение
5–10 мин с получением спиртового
экстракта. Далее, из экстракта
выделяют спирторастворимую и нерастворимую в спирте части.
Недостатком данного способа является сложность получения,
высокая стоимость.
83
Наиболее близким по технической сущности и достигаемому
положительному эффекту и принятый нами за прототип является
способ получения кормовой добавки из личинок трутней и подмора пчел, включающий сбор личинок трутней и подмора пчел и их
гомогенизацию (Лазарян Д. С., 1999).
Недостатком данного способа является то, что кормовая добавка не выдерживает длительного
срока хранения.
В связи с этим, для получения препарата из личинок трутней и
подмора пчел нами было проведено три опыта.
Опыт № 1. Собирали личинки трутней различного возраста с помощью вакуумного насоса из открытых специальным ножом сотов
с трутневым расплодом и очищали подмор пчел от примесей, затем смешивали их в соотношении 1:1 и гомогенизировали, причем
перед гомогенизацией сбор смешивали с 40° спиртом в соотношении 10:1. Замораживали при температуре –4 °С в течение 72 часов,
затем размораживали при комнатной температуре с последующим
добавлением 20 весовых частей искусственного желудочного сока
(3 %-ный пепсин и 1 %-ная соляная кислота), перемешивали, пробы закупоривали. Смесь инкубировали в термостате, в герметичной
таре, при температуре 39 °С в течение 48 часов, при этом перемешивая через 24 часа. Затем полученную смесь после окончания переваривания (определяется визуально от взвеси отходов производства
остается тонкий коричневый осадок) процеживали через 6 слоев
марли или сито и охлаждали. Полученную смесь доводили до рН 7,0
раствором 0,1N соляной кислоты или с помощью 0,1N гидроксида
натрия. Для консервации добавляли ацетилсалициловую кислоту, из
расчета одна таблетка на один литр кормовой добавки. Наличие посторонних примесей определяли, просматривая препараты на свету.
Кормовая добавка была непрозрачной, с осадком.
Опыт № 2. Все технологические операции проводили аналогично опыту № 1, но к одной весовой части соединенных в равных объемах (1:1) личинок трутней и подмора пчел прибавляли
десять весовых частей искусственного сока. Все перемешивали,
смесь инкубировали в сушильном шкафу в герметичной таре вначале при температуре 120 °С в течение одного часа, а затем при
температуре 39 °С в течение 24 часов периодически помешивая.
В полученной смеси рН доводили до 7,0 0,1N соляной кислотой
или 0,1N гидроксидом натрия. Смесь процеживали через шесть
слоев марли или сито; автоклавировали при температуре 120 °С в
84
течение 45 минут, разливали в стерильных условиях по флаконам,
укупоривали и использовали в качестве кормовой добавки. По вышеуказанной технологии кормовая добавка была прозрачной, с небольшим осадком.
Опыт № 3. проводили аналогично опытам № 1 и 2, но с добавлением одной весовой части искусственного желудочного сока и
перемешивали, пробы закупоривали. Смесь инкубировали в
мостате, в герметичной таре при
температуре 120 °С один час, а
тер-
затем при 39 °С в течение 48 часов, при этом перемешивали её через 24 часа. В полученной смеси рН доводили до 7,0 0,1N соляной
кислотой или 0,1 N гидроксидом натрия, После окончания «переваривания» смесь процеживали через шесть слоев марли или сито
и охлаждали, затем автоклавировали при температуре течение 45
минут, разливали в
стерильных условиях по флаконам, укупорива-
ли. Кормовая добавка была мутной с осадком.
Таким образом, по физическим свойствам кормовая добавка,
полученная во втором опыте, оказалась мелкодисперсной с небольшим осадком. В дальнейшем образцы, полученные в трёх опытах,
были обозначены, как образец № 1, 2, 3. Все полученные образцы
были проверены на стерильность и на безвредность
9.3.4. Микробиологические и токсикологические
исследования кормовой добавки из личинок
трутней и подмора пчёл
.
Стерильность каждого образца определяли согласно ГОСТ
28085 «Препараты биологические. Метод бактериологического
контроля стерильности». Высевы образцов кормовой добавки, полученных в трех опытах, проводили в стерильном боксе в ламинарном шкафу «ENVAIR».
На средах МПБ, МППБ под вазелиновым маслом, МПА и агаре
Сабуро с помощью стерильной пипетки и груши осуществляли высев образцов
кормовых добавок. Сначала набирали 0,3 мл образца
в пипетку и вносили в пробирки с МПБ, МППБ (под масло), МПА
и агар Сабуро, образец осторожно вынимали и закрывали ватными
пробками, так чтобы их не намочить. При высеве на агары добавку
засевали таким образом, чтобы она наслаивалась на скошенную
поверхность агара.
Все высевы с
МПБ, МППБ и МПА помещали в термостат при
температуре 37–38 °С, а агар Сабуро оставляли при комнатной
85
температуре, учет на стерильность проводили через 7, 14, 21, 28
дней (табл. 24).
Таблица 24
Результат культивирования препаратов на МПБ, МППБ,
МПА и агаре Сабуро
Рост микрофлоры, дней
7142128
№ опыта
МПБ
МПБ
МПА
1+++–+++–+++–+++–
2––––––––––––––––
3––––––––––––––––
Примечание: МПБ – мясо-пептонный бульон; МППБ – мясопептонный еночный бульон, МПА – мясо-пептонный агар, Сабуро – Агар
Сабуро. наличие роста, «–» – отсутствие роста.
Сабуро
МПБ
МППБ
МПА
Сабуро
МПБ
МППБ
МПА
Сабуро
МПБ
МПА
МППБ
Сабуро
Рост посторонней микрофлоры определяли визуально. В образце №1 уже на 1 сутки был отмечен рост посторонней микрофлоры
на МПБ, МППБ и МПА. При этом на МПБ и МППБ отмечали помутнение среды, в то время как бульоны образцов № 2 и 3 остались
прозрачными, а при визуальном осмотре образца № 1 на МПА
были
отмечены округлые мелкие колонии белого цвета.
Для более точного выяснения стерильности образцов провели
микроскопирование «проросших» сред. Для этого на чистое обезжиренное покровное стекло наносили одну каплю высева образца
на МПБ, сушили над пламенем спиртовки и окрашивали по Граму,
на окрашенное высушенное стекло нанесли иммерсионное масло.
Ту же операцию проводили
и с высевом на МППБ, МПА.
При микроскопировании мазков на микроскопе «БИОЛАМ
Ломо» при имении 90 в образце № 1 обнаружили колонии
Streptococcus и Clostridium, а в образцах № 2 и 3 посторонней
микрофлоры не обнаружили. Таким образом, образцы № 2 и 3,
которые изготавливались из личинок трутней и подмора пчёл
(1:1) при переваривании искусственным желудочным соком в
условиях
сушильного шкафа (при температуре 120°С 1 час) и
тер мостата (при температуре 39°С) 24 часа и 48 часов можно считать стерильным.
86
9.3.5. Оценка общей токсичности
и безвредности кормовой добавки
Нами определялась степень опасности кормовой добавки из
личинок трутней и подмора пчел.
Методика, применяемая нами, основана на определении острой
токсичности нашего препарата по реакции инфузорий, на внешнее
воздействие с исследованием в качестве тест-объекта инфузорий
Paramecium caudatum.
Определение степени опасности биологически активной кормовой добавки осуществляли по методике, описанной в разделе 9.2.5.
Добавку
перед исследованием разводили дистиллированной водой.
Отбор проб проводили в соответствии с ГОСТ 17.4.3.01–83.
Оценку общей токсичности пробы добавки из личинок трутней
и подмора пчел проводили по относительной разнице количества
клеток в верхних зонах кюветов в контрольной и анализируемой
пробе. Индекс токсичности определяли по формуле:
I
ср. контроль
________________
Т =
I
– I
ср. контроль
ср. опыт
,
где Т – индекс токсичности, I
контрольных и анализируемых проб, соответственно.
ср. контроль
и I
– средние показания прибора для
ср. опыт
Полученные результаты представлены в таблице 25.
Таблица 25
Степень токсичности проб кормовой добавки
№Тип пробы Средние показатели Токсичность, Т
00 Контроль 89,42 Не токсична
01 Опыт №1 163,76 допустимая
02 Опыт №2 68,34 допустимая
03 Опыт №3 73,47 допустимая
Из данных таблицы 25 следует, что пробы содержат безопасные, но привлекательные для инфузорий вещества, и значение активности инфузорий в одной опытной пробе несколько превышает
значение контроля. В тоже время, при формальном расчете получены отрицательные значения индекса токсичности Т, что свиде-
87
тельствует об отсутствии токсичности всех проб, а значения могут
быть оценены как нулевые. Таким образом, опытные пробы кормовых добавок из личинок трутней и подмора пчел не токсичны по
отношению к инфузориям Paramecium caudatum при определении
на приборе серии «Биотестер».
Кроме этого, токсичность наших препаратов мы определяли на
белых мышах. Для этого животным
однократно вводили внутрь
исследуемые образцы в различных дозах: 50, 200, 1000 и 5000 мг/
кг, а в качестве контроля использовали физиологический раствор в
тех же дозах (табл. 26).
Таблица 26
Определение токсичности кормовых добавок на белых мышах
Дозы, мл/кг
Образец 1
50
200
1000
5000
Образец 2
50
200
1000
5000
Образец 3
50
200
1000
5000
Физ. р–р
50
200
1000
5000
12 3456 7891011121314
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
Сутки
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
В результате случаев гибели животных не было установлено,
значит, испытанные препараты не токсичны для белых мышей.
Безвредность препаратов проверяли на лабораторных живот-
ных. Для этого белым лабораторным мышам подкожно вводили
88
0,5 мл кормовой добавки и вели наблюдение за их общим состоя-
нием в течение двух недель. На месте введения препарата образца
№ 1 у животных наблюдалось воспаление уже на следующий день,
а у мышей, которым вводили образцы № 2, 3 видимых патологических отклонений не обнаружено. Исходя из этого, образцы № 2 и
№ 3 можно считать безвредными (табл. 27).
Таблица 27
Показатели качества кормовых добавок
№ образца Стерильность Безвредность Токсичность
1+ + –
2–––
3–––
Анализируя результаты исследований, нами установлено, что
опытные препараты № 2 и 3 стерильны, не токсичны и безвредны.
Для дальнейших исследований и испытаний использовали образец
№ 2, так как он имеет наибольшую растворимость, стерильный,
безвредный, со сроком годности до 1 года.
Полученная кормовая добавка – это жидкость (в виде суспензии) коричневого цвета с небольшим осадком, легко
растворяющаяся при встряхивании, безвредная, стерильная и не токсичная.
В дальнейшем кормовая добавка из личинок трутней и подмора
пчёл, основанная на способе приготовления образца № 2 получила
название «БиоХит».
9.3.6. Химический состав кормовой добавки
Нами был изучен химический состав кормовой добавки. Ре-
зультаты состава «БиоХит» представлены в таблице 28.
Основные показатели химического состава
кормовой добавки «Биохит»
Показатель Содержание
Вода, г 975
Сухое вещество, г 25
Сырой жир, г 13
Таблица 28
89
Показатель Содержание
Сырой протеин, г 8,9
Аминокислоты (общая сумма), мг 6960
В т. ч.
незаменимые:
фенилаланин 900
лизин 600
лейцин 580
аргинин 550
валин 490
изолейцин 320
треонин 260
гистидин 220
метионин 30
заменимые:
глутаминовая 680
аланин 640
аспаргиновая 580
тирозин 490
глицин 430
серии 190
Сахар,г 2,6
Минеральные вещества (мг):
кальций 277
селен 30,0
медь 2,7
марганец 2,65
цинк 2,0
Витамины (мг): Е 15,0
В
5
В
12
13,0
1,0
Продолжение
90
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]