Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Формирование и характеризация тканевых сфероидов. Лабораторный практикум
.pdf
№ 4571
Научно-образовательная лаборатория тканевой инженерии
МИНИСТЕРСТВО НАУКИ И ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ РФ
УНИВЕРСИТЕТ НАУКИ И ТЕХНОЛОГИЙ МИСИС
ИНСТИТУТ БИОМЕДИЦИНСКОЙ ИНЖЕНЕРИИ
и регенеративной медицины
Е.В. Кудан
ФОРМИРОВАНИЕ
И ХАРАКТЕРИЗАЦИЯ
ТКАНЕВЫХ СФЕРОИДОВ
Лабораторный практикум
Рекомендовано редакционно-издательским
советом университета
Москва 2024
УДК 57.032
К88
Рецензент
директор Института биомедицинской инженерии Ф.С. Сенатов
Кудан, Елизавета Валерьевна.
К88 Формирование и характеризация тканевых сферо-
идов : лаб. практикум / Е.В. Кудан. –
тельский Дом НИТУ МИСИС, 2024. – 50 с.
В пособии даны описания 8 лабораторных работ для выполнения студентами в ходе учебной практики. Приведен необходимый теоретический материал, рассмотрены протоколы
формирования сфероидов с помощью наиболее используемых
методов и протоколы характеризации их основных биологических свойств, даны задачи и вопросы для самоконтроля.
Учебное пособие предназначено для студентов, обучающихся
в магистратуре по направлению подготовки 15.04.02 «Технологические машины и оборудование» (ПИШ МАСТ).
Москва : Изда-
УДК 57.032
Е.В. Кудан, 2024
НИТУ МИСИС, 2024
2
Содержание
Введение . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .4
Методы фабрикации сфероидов . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .6
Лабораторная работа 1. Фабрикация сфероидов
с помощью агарозных форм . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .7
Лабораторная работа 2. Фабрикация сфероидов методом
висячей капли . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .14
Методы характеризации сфероидов . . . . . . . . . . . . . . . . . . .18
Лабораторная работа 3. Измерение диаметров
и округлостей сфероидов . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .18
Лабораторная работа 4.
Анализ кинетики слияния сфероидов . . . . . . . . . . . . . . . . .25
Лабораторная работа 5.
Анализ кинетики распластывания сфероидов . . . . . . . . . . .32
Лабораторная работа 6. Качественная оценка
жизнеспособности сфероидов с помощью тест-системы
на живые и мертвые клетки . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .36
Лабораторная работа 7. Количественная оценка
жизнеспособности сфероидов с помощью тест-системы
CellTiter-Glo 3D . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .39
Лабораторная работа 8. Оценка биомеханических
свойств сфероидов с помощью микротензиометра . . . . . . . .43
Заключение . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .46
Библиографический список . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .47
3
ВВЕДЕНИЕ
Одной из важных задач современной биомедицины является разработка эффективных способов регенерации поврежденных органов и тканей. Решение этой задачи напрямую
связано с развитием таких инновационных направлений,
как тканевая инженерия и регенеративная медицина.
Особое значение при подготовке специалистов в области
тканевой инженерии и регенеративной медицины имеет их
практическая подготовка: владение современными методами исследования и культивирования биологических объектов, в частности трехмерных клеточных структур.
Цели курса: формирование знаний по основным методам
формирования и характеризации сфероидов.
Задачи курса:
– усвоение теоретических знаний о сфероидах, о влиянии различных факторов в процессе формирования и культивирования сфероидов на их биологические свойства;
– овладение навыками исследовательской работы
со сфероидами, ознакомление с методами и подходами к их
изучению;
– выработка умений использовать полученные знания
при выполнении научно-исследовательской работы.
Лабораторный практикум направлен на развитие следу-
ющих профессиональных компетенций:
– ОПК-6 – способность использовать современные информационно-коммуникационные технологии, глобальные
информационные ресурсы в научно-исследовательской деятельности;
– ОПК-12 – способность осуществлять моделирование,
анализ и эксперименты в целях проведения детального исследования для решения сложных задач в профессиональной области, разрабатывать современные методы исследования биологических объектов, оценивать и представлять
результаты выполненной работы;
4
– ПК-2 – способность планировать и осуществлять экспериментальные исследования, компьютерное моделирование, анализировать и обрабатывать результаты, делать
выводы, составлять и оформлять отчеты по проведенным
исследованиям в области тканевой инженерии и регенеративной медицины.
Знания, полученные студентами в результате выполнения заданий лабораторного практикума, могут быть применены ими в дальнейшей профессиональной деятельности.
5
МЕТОДЫ ФАБРИКАЦИИ СФЕРОИДОВ
К настоящему моменту уже разработано большое количество способов формирования сфероидов [1–3]. Среди них
методы, основанные на применении различных физических полей, микрофлюидных устройств, перемешивающих
биореакторов, добавлении специальных компонентов, таких как RGD-пептид, в культуральную среду [4]. Каждый
из этих методов имеет свои преимущества и недостатки. Так,
например, использование перемешивающих биореакторов
позволяет получать большое количество сфероидов и культивировать их длительное время в значительном объеме
культуральной среды, однако у исследователя нет возможности точно контролировать количество и размер сфероидов.
При использовании физических полей можно формировать
сфероиды из заданного количества клеток и даже получать гетеросфероиды из нескольких типов клеток. Но данный метод плохо поддается масштабированию. Применение
микрофлюидных устройств для инкапсулирования клеток
в двойной эмульсии вода-в-масле-в-воде позволяет быстро
получать тысячи и даже десятки тысяч сфероидов. Однако
сформированные сфероиды заключены в гидрофобную капсулу, которая ограничивает их дальнейшее применение.
Кроме того, формирование сфероидов с помощью микрофлюидных устройств, физических полей или перемешивающих
биореакторов требует наличия специального оборудования.
В данном пособии мы остановимся на тех методах, которые позволяют формировать большое количество унифицированных сфероидов заданного диаметра в условиях
стандартной клеточной лаборатории без применения специфического оборудования.
6
Лабораторная работа 1
ФАБРИКАЦИЯ СФЕРОИДОВ
С ПОМОЩЬЮ АГАРОЗНЫХ ФОРМ
(4 часа)
1.1. Цель работы
1. Научиться формировать агарозные формы для после-
дующей фабрикации сфероидов.
2. Научиться формировать сфероиды с помощью создан-
ных агарозных форм.
1.2. Теоретическое введение
Самая популярная и удобная технология производства
сфероидов основана на размещении клеток на поверхности с низкими адгезивными свойствами [1, 2, 5]. Компания
Microtissues производит силиконовые штампы, с помощью
которых можно сформировать неадгезивные формы из расплавленной агарозы. Каждая форма позволяет получить 81
или 256 сфероидов в зависимости от типа исходного силиконового штампа. Горячий раствор 2%-ной агарозы в натрийфосфатном буфере вносится в силиконовый штамп. После
охлаждения до комнатной температуры агароза застывает и превращается в гель. Полученная агарозная форма извлекается из штампа. Суспензия клеток объемом 190 мкл
вносится в агарозную форму. В течение 60–120 мин клетки
под действием силы тяжести оседают на дно ячеек. Клетки
не могут прикрепиться к неадгезивной поверхности, поэтому они вынуждены плотно взаимодействовать друг с другом
и образовывать сфероиды (рис. 1.1).
Данная технология является дешевым и простым способом масштабируемого производства сфероидов. Однако
использование агарозных форм для фабрикации сфероидов подразумевает внесение клеточной суспензии во всю
форму целиком, а затем уже самопроизвольное распределе-
7
ние ее по ячейкам. Это приводит к тому, что исследователь
не может точно контролировать количество клеток в каждой
ячейке агарозной формы. В ситуации, когда агарозная форма имеет идеально плоское дно, наблюдается равномерное
распределение суспензии и во все лунки попадает одинаковое количество клеток. Однако даже малейшие отклонения
в геометрии дна агарозных форм приводят к тому, что в центральные лунки попадает больше (либо меньше) клеток, чем
в краевые лунки. Это приводит к значительным колебаниям в диаметрах образующихся сфероидов. Еще одним недостатком данного метода является невозможность проводить
исследования на каждом отдельном сфероиде. Любые манипуляции, такие как добавление ростовых факторов, лекарственных препаратов, различных тест-систем и пр., осуществляются на агарозной форме целиком.
aб
где
Агароза Клеточная суспензия Сфероиды
Рис. 1.1. Иллюстрация технологии формирования
сфероидов с помощью агарозных форм: а – фотография
силиконового штампа; б – фотография пустой агарозной
формы; в – фотография агарозной формы со сфероидами;
г – схематичное изображение пустой агарозной формы;
д – схематичное изображение агарозной формы
с суспензией клеток; е – схематичное изображение
агарозной формы со сфероидами
8
в
1.3. Реактивы, материалы и оборудование
Реактивы:
– питательная среда ДМЕМ;
– фетальная бычья сыворотка;
– антибиотик / антимикотик;
– раствор Версена;
– 0,25% трипсин-ЭДТА;
– натрий-фосфатный буфер;
– агароза.
Материалы:
– 12-луночные культуральные планшеты;
– серологические пипетки на 50, 25, 10 и 1 мл;
– одноканальные механические пипетки на 0,5–10, 10–
100 и 100–1000 мкл;
– полипропиленовые стерильные пробирки на 15 и 50 мл;
– камера Горяева;
– микро-молды для создания агарозных форм;
– наконечники для пипеток на 10, 200 и 1000 мкл;
– чашки Петри 10020 мм.
Оборудование:
– инвертированный микроскоп;
– ламинар, класс II;
-инкубатор;
–CO
2
– центрифуга;
– микроволновая печь.
1.4. Порядок выполнения работы
1.4.1. Создание агарозных форм с помощью
микро-молдов
Важно! Все процедуры проводятся под ламинаром!
1. Взвесьте в стеклянной колбе 2 г агарозы.
2. Добавьте 100 мл стерильного натрий-фосфатного буфе-
ра в колбу, содержащую 2 г агарозы.
9
3. Используя микроволновую печь, растворите агарозу
в натрий-фосфатном буфере, так чтобы получился полностью прозрачный раствор. Останавливайте микроволновую
печь каждые 10–15 с и перемешивайте содержимое колбы,
чтобы агароза растворялась более равномерно.
4. После получения прозрачного раствора агарозы дождитесь, пока он остынет до 60–70 °С, и внесите по ~500 мкл
раствора в микро-молды для создания агарозных форм. Избегайте пузырьков при внесении раствора агарозы.
5. После того как агароза застынет (приблизительно через 4 мин), переверните микро-молды для создания агарозных форм и аккуратно выдавите из них образовавшиеся агарозные формы.
6. Используйте агарозные формы сразу или поместите
в 2-кратный раствор антибиотика / антимикотика в натрийфосфатном буфере и храните при 4 °С.
1.4.2. Создание тканевых сфероидов с помощью
агарозных форм
Важно! Все процедуры проводятся под ламинаром!
1. Поместите в каждую из ячеек 12-луночного культурального планшета по одной агарозной форме, добавьте
по 2,5 мл питательной среды и поставьте в CO
-инкубатор
2
на 20 или более минут.
2. Удалите питательную среду из флакона, содержащего
монослой клеток.
3. Промойте монослой клеток раствором Версена, чтобы
удалить следы сыворотки, которые могут содержать ингибиторы трипсина.
4. Добавьте раствор 0,25% трипсин-ЭДТА (0,5 мл на флакон Т75) и аккуратно покачайте флакон, чтобы раствор равномерно распределился по всей поверхности дна. Инкубируйте 3–5 мин при комнатной температуре или при 37 °С.
5. Через несколько минут, когда клетки открепятся
от подложки, добавьте небольшое количество питательной
среды и приготовьте клеточную суспензию с необходимой
концентрацией.
10
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]