Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Формирование и характеризация тканевых сфероидов. Лабораторный практикум
.pdf
6. Достаньте из CO2-инкубатора 12-луночный планшет
с агарозными формами, тщательно отберите питательную
среду вокруг агарозных форм и внесите по 190 мкл клеточной суспензии в каждую из агарозных форм. Инкубируйте
в CO
-инкубаторе при 37 °С и 5% CO2 в течение 60–90 мин.
2
7. Через 90–120 мин добавьте по 2,5 мл питательной среды в ячейки 12-луночного культурального планшета, содержащего агарозные формы с клетками. Через 1 день тканевые
сфероиды сформируются. Инкубируйте тканевые сфероиды
в CO2-инкубаторе при 37 °С и 5% CO2. Меняйте питательную
среду по мере необходимости.
8. Для получения изображений сфероидов используйте инвертированный микроскоп, оснащенный цифровой камерой.
1.4.3. Извлечение тканевых сфероидов
из агарозных форм
Важно! Все процедуры проводятся под ламинаром!
Аккуратно удалите основую часть питательной среды
из каждой из ячеек 12-луночного культурального планшета,
содержащего агарозные формы со сфероидами, оставив 500–
1000 мкл среды.
Пипетируйте среду на агарозную форму до тех пор, пока
все сфероиды не выплывут из формы.
Соберите питательную среду, содержащую сфероиды,
в полипропиленовую пробирку на 15 или 50 мл.
1.5. Требования к отчету о работе
Отчет должен содержать:
1) цель работы;
2) краткое изложение теории;
3) фотографии сформированных сфероидов.
Задачи
1. Рассчитайте общее количество клеток, необходимое
для приготовления 12 молдов, содержащих по 81 сфероиду
из 6000 клеток.
11
2. Рассчитайте количество агарозы (в граммах) для приготовления 20 хороших агарозных форм при условии, что
5% форм получатся бракованными, мертвый объем составляет 10 мл, концентрация агарозы 1,8%, а на приготовление
одной формы нужно 500 мкл раствора.
3. У вас есть 5 млн клеток. Определите, сколько молдов
из 256 сфероидов по 1000 клеток вы сможете приготовить.
4. У вас есть 1 мл суспензии клеток с концентрацией
2,7 млн клеток/мл. Определите, сколько молдов из 256 сфероидов по 1000 клеток вы сможете приготовить.
5. У вас есть 3,2 г агарозы. Рассчитайте, какое количество агарозных форм вы сможете приготовить, если для
приготовления одной агарозной формы необходимо 500 мкл
1,8% раствора агарозы.
6. Вам необходимо приготовить 23 агарозные формы, содержащие по 256 сфероидов из 1300 клеток. Определите,
какой объем суспензии клеток и с какой концентрацией вам
необходимо приготовить, если в каждую агарозную форму
нужно внести по 190 мкл суспензии.
7. У вас есть 2,1 г агарозы, из которой вы можете приготовить агарозные формы, содержащие 256 ячеек. Для
приготовления одной формы необходимо 500 мкл 1,8% раствора агарозы. Считаем, что все формы получатся хорошо
и не будет бракованных форм. Определите, какое общее количество клеток необходимо для формирования сфероидов
из 1400 клеток, чтобы заполнить все приготовленные формы.
8. У вас есть 1,7 г агарозы, из которой вы можете приготовить агарозные формы, содержащие 81 ячейку. Для приготовления одной формы необходимо 500 мкл 1,8% раствора
агарозы. Считаем, что 10% форм получатся бракованными.
Рассчитайте, какое общее количество клеток необходимо
для формирования сфероидов из 5000 клеток, чтобы заполнить все хорошие приготовленные формы.
9. У вас есть 35 мл клеточной суспензии с концентрацией
450 тыс. клеток/мл. Одновременно с этим у вас есть 1 г агарозы. Определите, какое количество сфероидов из 1000 кле-
12
ток вы сможете приготовить с помощью агарозных форм, содержащих 256 ячеек, если на приготовление одной формы
нужно 500 мкл 1,8% раствора агарозы.
10. У вас есть 20 мл клеточной суспензии с концентрацией 650 тыс. клеток/мл. Одновременно с этим у вас есть
1,2 г агарозы. Рассчитайте, какое количество сфероидов
из 3000 клеток вы сможете приготовить с помощью агарозных форм, содержащих 81 ячейку, если на приготовление
одной формы нужно 500 мкл 1,8% раствора агарозы.
13
Лабораторная работа 2
ФАБРИКАЦИЯ СФЕРОИДОВ МЕТОДОМ
ВИСЯЧЕЙ КАПЛИ
(2 часа)
2.1. Цель работы
Научиться формировать сфероиды методом висячей капли.
2.2. Теоретическое введение
В классическом варианте метода висячей капли суспензия клеток наносится в виде капель объемом 25–35 мкл
на перевернутую крышку чашки Петри, после чего крышка
обратно переворачивается и аккуратно надевается на чашку Петри [1, 2, 6]. Чашку Петри необходимо частично заполнить натрий-фосфатным буфером или питательной средой для того, чтобы уменьшить испарение влаги из капель
(рис. 2.1).
Суспензия клеток
Рис. 2.1. Иллюстрация технологии формирования
Под действием силы тяжести клетки оседают на дно капель и формируют сфероиды. В каждой капле, таким обра-
Натрий-фосфатный буфер
сфероидов методом висячей капли
14
зом, образуется по одному сфероиду. Данный метод позволяет четко контролировать количество клеток в каждой капле,
а также получать сфероиды, состоящие из нескольких типов
клеток. Однако в классическом варианте метод висячей капли является очень трудоемким, его невозможно автоматизировать и масштабировать. Кроме того, вместо шарообразных
сфероидов часто образуются агрегаты неправильной формы,
нередко содержащие так называемые сателлиты, маленькие
конгломераты из клеток, не вошедших в основной сфероид.
В настоящее время существуют коммерческие 96и 384-луночные планшеты для формирования сфероидов методом висячей капли (рис. 2.2).
Рис. 2.2. Формирование сфероидов методом висячей
капли с помощью планшетов
Данные планшеты позволяют применять многоканальные пипетки или роботизированное автоматическое оборудование для дозирования клеточной суспензии и создания
капель, а также последующего извлечения образовавшихся
сфероидов, что дает возможность значительно масштабировать процесс. Однако смена среды, добавление каких-либо соединений к сфероидам, их визуализация и анализ все
равно вызывают сложности. Еще одним ограничением метода является объем капли, который не должен превышать
50 мкл (оптимально 25–35 мкл), в противном случае поверхностное натяжение будет недостаточным для удержания
капли, и она может упасть. Следовательно, из-за небольших
объемов и недостаточного количества питательных веществ
15
метод висячей капли не может использоваться для длительного культивирования сфероидов.
2.3. Реактивы, материалы и оборудование
См. лабораторную работу 1.
2.4. Порядок выполнения работы
Важно! Все процедуры проводятся под ламинаром!
1. Удалите питательную среду из флакона, содержащего
монослой клеток.
2. Промойте монослой клеток раствором Версена, чтобы
удалить следы сыворотки, которые могут содержать ингибиторы трипсина.
3. Добавьте раствор 0,25% трипсин-ЭДТА (0,5 мл на флакон Т75) и аккуратно покачайте флакон, чтобы раствор равномерно распределился по всей поверхности дна. Инкубируйте 3–5 мин при комнатной температуре или при 37 °С.
4. Через несколько минут, когда клетки открепятся
от подложки, добавьте небольшое количество питательной
среды и приготовьте клеточную суспензию с необходимой
концентрацией.
5. Снимите с чашки Петри крышку, переверните ее и нанесите капли клеточной суспензии объемом 35 мкл на перевернутую крышку.
6. Внесите 30 мл раствора натрий-фосфатного буфера
в чашку Петри.
7. Аккуратно переверните крышку с каплями суспензии
и наденьте ее на чашку Петри. Через 1 день тканевые сфероиды сформируются. Инкубируйте тканевые сфероиды в CO2инкубаторе при 37 °С и 5% CO2. Меняйте питательную среду
по мере необходимости.
8. Для получения изображений сфероидов аккуратно
снимите крышку с чашки Петри и фотографируйте сфероиды с помощью инвертированного микроскопа, оснащенного
цифровой камерой.
16
2.5. Требования к отчету о работе
Отчет должен содержать:
1) цель работы;
2) краткое изложение теории;
3) фотографии сформированных сфероидов.
Задачи
1. Рассчитайте общий объем клеточной суспензии, необходимый для приготовления методом висячей капли 15 чашек Петри, содержащих по 20 сфероидов, если объем каждой капли составляет 35 мкл.
2. Рассчитайте количество клеток для приготовления
18 чашек Петри, содержащих по 25 сфероидов, состоящих
из 4500 клеток.
3. У вас есть 5 млн клеток. Определите, сколько чашек
Петри, содержащих по 32 сфероида из 1500 клеток, вы сможете приготовить.
4. У вас есть 1 мл суспензии клеток с концентрацией
1,2 млн клеток/мл. Рассчитайте, сколько чашек Петри, содержащих по 25 сфероидов из 4000 клеток, вы сможете приготовить.
5. У вас есть 35 мл клеточной суспензии с концентрацией
450 тыс. клеток/мл. Определите, какое количество сфероидов из 7000 клеток вы сможете приготовить методом висячей капли, если объем капель составляет 35 мкл.
6. У вас есть 20 мл клеточной суспензии с концентрацией 150 тыс. клеток/мл. Определите, какое количество сфероидов из 8000 клеток вы сможете приготовить методом висячей капли, если объем капель составляет 35 мкл.
17
МЕТОДЫ ХАРАКТЕРИЗАЦИИ СФЕРОИДОВ
Лабораторная работа 3
ИЗМЕРЕНИЕ ДИАМЕТРОВ
И ОКРУГЛОСТЕЙ СФЕРОИДОВ
(5 дней)
3.1. Цель работы
1. Научиться измерять диаметры и округлости сфероидов в программе ImageJ.
2. Научиться строить диаграммы зависимости диаметров и округлостей сфероидов от времени.
3.2. Теоретическое введение
Размер сфероида, его форма, а также их изменение в процессе культивирования – критические параметры, которые
необходимо знать при использовании сфероидов [1, 2, 7].
Например, увеличение диаметра сфероида свидетельствует
о пролиферации клеток в его составе, что очень важно при
тестировании цитостатиков на сфероидах. Для характеризации сфероидов обычно используются диаметр и округлость.
Округлость показывает, насколько форма сфероида (его проекции на плоскость) близка к идеальному кругу. Она описывается дробными значениями, не превосходящими 1,0. Значение 1,0 соответствует идеальному кругу.
Для оценки кинетики изменения диаметров и округлостей сфероидов проводится их фотографирование на разных
сроках культивирования с помощью микроскопа, оснащенного цифровой камерой. За этим следует обработка полученных изображений в программе ImageJ (NIH, Bethesda, MD,
США). На первом этапе путем порогового преобразования
необходимо получить упрощенные изображения в градациях серого, после чего определить границы сфероидов и измерить диаметр Ферета в пикселях. Значения диаметров могут
18
быть переведены в микрометры путем сравнения с размерной шкалой. Округлость сфероидов также может быть автоматически рассчитана в программе ImageJ по формуле
×
Округлость= .
4площадь
π×
большая ось
2
Диаметр и округлость сфероидов, а также кинетика их
изменения зависят от многих факторов, таких как тип клеток, их концентрация, срок культивирования, метод фабрикации и др. Некоторые сфероиды имеют круглую форму
на протяжении всего срока культивирования, например сфероиды из клеток линии HEK293 – эмбрионального эпителия
почки человека. Другие начинают вытягиваться и приобретают эллипсоидную форму со временем, например сфероиды
из клеток линии L6 – миобластов крысы (рис. 3.1).
Рис. 3.1. 3-суточные сфероиды из клеток линий
HEK293 и L6
Известно, что чем меньше первоначальное количество
клеток в сфероиде, тем выше скорость его роста (в случае растущих сфероидов), но ниже скорость его уплотнения (в случае уплотняющихся сфероидов) (рис. 3.2) [1, 8].
19
HEK293
1000 кл/сф 3375 кл/сф 8000 кл/сф 16 000 кл/сф 27 000 кл/сф
1200
1100
1000
900
800
700
600
500
400
Диаметр, мкм
300
200
100
0
12369 12369 12369 12369 12369
День культивирования
Фибробласты человека
1000 кл/сф 3375 кл/сф 8000 кл/сф 16 000 кл/сф 27 000 кл/сф
700
600
500
400
300
200
Диаметр, мкм
100
0
12369 12369 12369 12369 12369
День культивирования
Рис. 3.2. Зависимости диаметров сфероидов из клеток
линии HEK293 и первичных фибробластов человека
от срока культивирования [8]
При сравнении диаметров сфероидов, сформированных
из одинакового количества клеток, но разными методами,
установлено, что в коммерческих планшетах с низкоадгезивным покрытием формируются более крупные сфероиды,
чем в агарозных формах, что, вероятно, связано с геометрией и размером ячеек в планшетах и в агарозных формах
(рис. 3.3) [1, 8].
20
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]