Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Формирование и характеризация тканевых сфероидов. Лабораторный практикум
.pdf
7.3. Реактивы, материалы и оборудование
Реактивы – см. лабораторную работу 1 + тест-система
CellTiter-Glo 3D.
Материалы – см. лабораторную работу 1 + 96-луночный
культуральный планшет.
Оборудование – см. лабораторную работу 1 + планшетный анализатор.
7.4. Порядок выполнения работы
1. Сформируйте сфероиды с помощью агарозных форм
(см. лабораторную работу 1).
2. Перенесите необходимое количество сфероидов в 96-лу-
ночный планшет по одному сфероиду в лунку.
3. Отберите от сфероидов культуральную среду.
4. Добавьте к контрольным сфероидам по 100 мкл свежей
культуральной среды.
5. Добавьте к экспериментальным сфероидам по 100 мкл
тестируемого вещества в нужной концентрации.
6. Инкубируйте в течение необходимого количества времени (обычно для лекарственных препаратов это 24, 48 или
72 ч).
7. Отберите из всех лунок по 50 мкл жидкости.
8. Добавьте во все лунки по 50 мкл тест-системы CellTiter-
Glo 3D.
9. Инкубируйте 30–90 мин.
10. Считайте люминесцентный сигнал, используя планшетный анализатор.
11. Абсолютные значения люминесценции нормализуйте
следующим образом: сигнал люминесценции контрольных
сфероидов принять за 100% жизнеспособности. Жизнеспособность экспериментальных сфероидов рассчитать как процентное отношение сигнала люминесценции экспериментальных и контрольных сфероидов. Сигнал культуральной
среды без сфероидов используйте в качестве фонового сигнала, который необходимо вычесть из сигналов контрольных
и экспериментальных сфероидов.
41
7.5. Требования к отчету о работе
Отчет должен содержать:
1) цель работы;
2) краткое изложение теории;
3) диаграммы зависимости жизнеспособности сфероидов
от концентрации тестируемого вещества.
Задачи
1. Определите, чему равна жизнеспособность клеток
в сфероидах, обработанных доксорубицином, если средний
люминесцентный сигнал контрольных сфероидов равен
1500 отн. ед., средний люминесцентный сигнал культуральной среды без сфероидов равен 400 отн. ед, а средний люминесцентный сигнал тестируемых сфероидов равен 1100 отн.
ед. Ответ выразите в процентах жизнеспособности относительно контрольных сфероидов.
2. В Задаче 1 слово «люминесцентный» заменили
на «флуоресцентный». Скажите, может ли это повлиять
на достоверность полученных результатов.
42
Лабораторная работа 8
ОЦЕНКА БИОМЕХАНИЧЕСКИХ
СВОЙСТВ СФЕРОИДОВ С ПОМОЩЬЮ
МИКРОТЕНЗИОМЕТРА
(2 часа)
8.1. Цель работы
Научиться оценивать биомеханические свойства сферои-
дов методом тензиометрии.
8.2. Теоретическое введение
Для использования сфероидов в тканевой инженерии
очень важно, чтобы полученные тканевые структуры обладали теми же механическими характеристиками, что и воспроизводимая ткань [1, 18]. Количественная оценка механических свойств сфероидов позволяет выяснить, насколько
приближены эти параметры к параметрам нативной ткани.
Кроме того, она позволяет прогнозировать процессы слияния и распластывания сфероидов, а также является косвенной оценкой их жизнеспособности.
Существует большое количество методов, позволяющих проанализировать механические свойства сфероидов.
К ним относятся атомно-силовая микроскопия, сканирующая ион-проводящая микроскопия, центрифугирование,
аспирация микропипеткой и др. Однако наиболее часто
используемым методом, позволяющим провести оценку
на уровне целого сфероида, является метод сжатия между
параллельными пластинами, изначально предложенный
Стейнбергом с соавт. Компания Cellscale разработала прибор Microsquisher для измерения механических свойств биологических объектов (сфероидов, микротканей, гидрогелей)
размером от 50 мкм до 2000 мкм данным методом. Принцип
работы устройства основан на измерении прогиба микроинструмента (стержня), закрепленного консольно. В результа-
43
те испытания регистрируется первичная диаграмма сжатия
в координатах «перемещение – сила». В состав устройства
входит контроллер температуры среды, обеспечивающий
температуру (37 °С) биологического объекта при испытании.
До начала экспериментов рабочую камеру заполняют натрий-фосфатным буфером. Сфероид помещается в рабочую
камеру на металлический блок. С помощью панели управления пластина позиционируется точно над сфероидом. Далее
в автоматическом режиме выполняется тест на сжатие сфероида. На основании полученных данных можно рассчитать
модуль упругости.
8.3. Реактивы, материалы и оборудование
Реактивы, материалы – см. лабораторную работу 1.
Оборудование – см. лабораторную работу 1 + микротензиометр.
8.4 Порядок выполнения работы
1. Сформируйте тканевые сфероиды с помощью агароз-
ных форм (см. лабораторную работу 1).
2. Заполните рабочую камеру микротензиометра натрий-
фосфатным буфером.
3. Включите микротензиометр и контроллер температуры.
4. Установите температуру 37 °С на контроллере, нажав кнопку ENABLE. Убедитесь, что загорелась надпись
HEATER ON. На экране контроллера будет отображаться заданная температура (37 °С) и реальная температура в рабочей камере.
5. Откройте программу SquisherJoy.
6. Создайте новый проект, нажав File Collect New. Вы-
берете из списка подходящий шаблон (template), соответствующий используемому стержню. Задайте директорию,
в которую будут сохраняться данные. Остальные настройки,
заданные по умолчанию: сжатие 50% объема от изначального диаметра, время сжатия 20 с, время выдержки 5 с, время
разгрузки 20 с.
44
7. С помощью пипетки поместите сфероид на металличе-
0
ский блок в рабочей камере.
8. С помощью панели управления позиционируйте пластину точно над сфероидом.
9. С помощью ручного манипулятора наведите камеру
с линзой на сфероид и с помощью передвижения вперед / назад установите ее в фокусе сфероида.
10. В автоматическом режиме выполните тест на сжатие
сфероида, нажав кнопку на верхней панели.
11. На основе полученных диаграмм напряжение–перемещение рассчитайте модуль упругости по касательной
на участке кривой до деформации 20%.
12. Напряжение для каждого шага измерения рассчитывается по формуле
F
i
σ=
,
i
S
где Fi – сила на шаге измерения при сжатии; S0 – изначаль-
ная площадь поперечного сечения сфероида.
Деформация сфероидов при вертикальном сжатии рас-
считывается по формуле
Base Disp Tip Disp
ε=
−
,
D
где D0 – начальный диаметр сфероида.
Модуль упругости рассчитывается по формуле
i
.
Eσ=
ε
8.5. Требования к отчету о работе
Отчет должен содержать:
1) цель работы;
2) краткое изложение теории;
3) расчет модуля упругости на основе данных, полученных при измерении механических свойств сфероидов. Обратите внимание на единицы измерения различных величин.
45
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В результате выполнения лабораторных работ студенты
научились формировать сфероиды несколькими наиболее
используемыми методами, оценивать их основные биологические свойства: морфометрические характеристики, жизнеспособность, механические свойства, а также способность
к слиянию и распластыванию.
46
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК
1. Кудан Е.В. Сфероиды как универсальная исследова-
тельская платформа: 03.03.04. М., 2022. 266 с.
2. Грядунова А.А., Буланова Е.А., Кудан Е.В., Перейра Ф.Д.С., Хесуани Ю.Д., Миронов В.А. Масштабируемая
биофабрикация и морфологическая оценка тканевых сфероидов // Клиническая и экспериментальная морфология.
2019. № 8(2). С. 12–20.
3. Shyam R., Reddy L.V.K., Palaniappan A. Fabrication
and Characterization Techniques of In Vitro 3D Tissue Models.
Int J Mol Sci. 2023. 24(3). Р. 1912.
4. Akasov R., Zaytseva-Zotova D., Burov S., Leko M., Dontenwill M., Chiper M., Vandamme T., Markvicheva E. Formation of multicellular tumor spheroids induced by cyclic
RGD-peptides and use for anticancer drug testing in vitro. Int
J Pharm. 2016. 506(1–2). Р. 57–148.
5. Caprio N.D., Burdick J.A. Engineered biomaterials to
guide spheroid formation, function, and fabrication into 3D
tissue constructs // Acta Biomater. 2023. 165. Р. 4–18.
6. Rasouli M., Safari F., Kanani M.H., Ahvati H.
Prin ciples of Hanging Drop Method (Spheroid Formation) in Cell Culture // Methods Mol Biol. 2024 Feb 28.
doi: 10.1007/7651_2024_527.
7. Thakuri P.S., Gupta M., Plaster M., Tavana H. Quantitative Size-Based Analysis of Tumor Spheroids and Responses to The rapeutics // Assay Drug Dev Technol. 2019. 17(3).
Р. 140–149.
8. Koudan E.V., Gryadunova A.A., Karalkin P.A., Korneva J.V., Meteleva N.Y., Babichenko I.I., Volkov A.V., Rodionov S.A., Parfenov V.A., Pereira F. DAS, Khesuani Y.D.,
Mironov V.A., Bulanova E.A. Multiparametric Analysis of Tissue Spheroids Fabricated from Different Types of Cells // Biotechnol J. 2020. 15(5), 1900217.
9. Кудан Е.В., Кудан С.П., Каршиева С.Ш., Хесуани Ю.Д., Миронов В.А., Буланова Е.А. Определение
активности цитостатиков в 3D-условиях культивирования
47
в сравнении с монослойной культурой // Цитология. 2021.
№ 63(3). С. 244–255.
10. Susienka M.J., Wilks B.T., Morgan J.R. Quantifying
the kinetics and morphological changes of the fusion of spheroid building blocks // Biofabrication. 2016. 8(4). 045003.
11. Hajdu Z., Mironov V., Mehesz A.N., Norris R.A., Markwald R.R., Visconti R.P. Tissue spheroid fusion-based in vitro
screening assays for analysis of tissue maturation // J Tissue
Eng Regen Med. 2010. 4(8). Р. 659–664.
12. Parfenov V.A., Koudan E.V., Bulanova E.A., Karalkin P.A., Pereira F.D., Norkin N.E., Knyazeva A.D., Gryadunova A.A., Petrov O.F., Vasiliev M.M., Myasnikov M.I.,
Chernikov V.P., Kasyanov V.A., Marchenkov A.Y.,
Brakke K.A., Khesuani Y.D., Demirci U., Mironov V.A.
Scaffold- free, label-free and nozzle-free biofabrication technology using magnetic levitational assembly // Biofabrication. 2018. 10(3). 034104.
13. Chen D., Yang L., Chen X., Zhang X., Liu Y., Guo Z.,
Zhang L.W. Automated contour analysis of multi-cellular
spheroids spreading through high content imaging // Phys
Biol. 2018. 15(2). 026006.
14. Bulygina I.N., Karshieva S.S., Permyakova E.S., Korol A.A., Kolesnikov E.A., Choudhary R., Senatov F.S., Koudan E.V. In vitro evaluation of doxorubicin release from diopside particles on MG-63 and HF spheroids as a 3D model
of tumor and healthy tissues // Toxicol In Vitro. 2024. 98.
105830.
15. Debruyne A.C., Okkelman I.A., Dmitriev R.I. Balance
between the cell viability and death in 3D // Semin Cell Dev
Biol. 2023. 144. Р. 55–66.
16. Kijanska M., Kelm J. In vitro 3D Spheroids and Microtissues: ATP-based Cell Viability and Toxicity Assays. 2016
Jan 21. In: Markossian S. et al., editors. Assay Guidance Manual [Internet]. Bethesda (MD): Eli Lilly & Company and the National Center for Advancing Translational Sciences; 2004.
17. Ivanov D.P., Grabowska A.M., Garnett M.C. (2018).
High-throughput spheroid screens using volume, resazurin reduc-
48
tion and acid phosphatase activity // In D.F. Gilbert, O. Friedrich
(Eds.); Cell Viability Assays (43–59). Humana Press (Springer).
URL: https://doi.org/10.1007/978-1-4939-6960-9_4
18. Efremov Y.M., Zurina I.M., Presniakova V.S., Kosheleva N.V., Butnaru D.V., Svistunov A.A., Rochev Y.A., Timashev P.S. Mechanical properties of cell sheets and spheroids:
the link between single cells and complex tissues // Biophys
Rev. 2021. 13(4). Р. 541–561.
49
Учебное издание
Кудан Елизавета Валерьевна
ФОРМИРОВАНИЕ И ХАРАКТЕРИЗАЦИЯ
ТКАНЕВЫХ СФЕРОИДОВ
Лабораторный практикум
Корректор В.В. Демидова
Технический редактор Т.В. Суханова
Верстальщик Ю.Б. Пашкова
Подписано в печать 16.11.24 Уч.-изд. л. 3,125
Формат 60 90 1/16
Университет науки и технологий МИСИС,
119049, Москва, Ленинский пр-кт, д. 4, стр. 1
Издательский Дом НИТУ МИСИС,
119049, Москва, Ленинский пр-кт, д. 2А
Тел. 8 (495) 638-44-06
Отпечатано в типографии
Издательского Дома НИТУ МИСИС,
119049, Москва, Ленинский пр-кт, д. 4А
Тел. 8 (495) 638-44-16, 8 (495) 638-44-43
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]