Добавил:

ivanov666 Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.

Вуз:

Башкирский Государственный Аграрный Университет

Предмет:

[НЕСОРТИРОВАННОЕ]

Файл:

Формирование и характеризация тканевых сфероидов. Лабораторный практикум

.pdf

Скачиваний:

Добавлен:

07.09.2026

Размер:

2 Мб

Скачать

☆

<<< < Предыдущая 1 2 34 / 54 5 > Следующая >>>

Таблица 4.2

Углы слияния сфероидов в зависимости от срока

культивирования сфероидов

1 день 3 дня 6 дней 10 дней

Часы

Angle, ° SD N Angle, ° SD N Angle, ° SD N Angle, ° SD N

0,5 45,2 2,5 10 37,7 6,3 10 31,4 10,6 10 25,8 12,4 10

2 93,4 18,4 10 85,2 15,8 10 79,5 21,3 10 74,3 13,5 10

4 148,8 14,7 10 136,5 19,2 10 129,3 15,2 10 108,8 16,6 10

6 163,3 19,8 10 155,4 12,7 10 146,9 16,9 10 143,9 17,2 10

24 178,1 12,4 10 174,8 17,3 10 168,4 22,2 10 159,0 20,7 10

Примечание. Angle – угол слияния сфероидов. SD – стандартное

отклонение. N – количество сфероидов.

Лабораторная работа 5

АНАЛИЗ КИНЕТИКИ

РАСПЛАСТЫВАНИЯ СФЕРОИДОВ

(4 дня)

5.1. Цель работы

1. Научиться измерять площадь распластывания сфероидов в программе ImageJ.

2. Научиться строить кривые зависимости площади распластывания сфероидов от времени.

5.2. Теоретическое введение

Способность сфероидов распластываться на адгезивной поверхности является важной характеристикой, которую необходимо учитывать при использовании сфероидов в регенеративной медицине и тканевой инженерии [1, 2, 13]. Кроме того, оценка распластывания может быть использована для анализа жизнеспособности сфероидов, действия различных агентов на сфероиды, а также для моделирования поведения опухолей. На распластывание сфероидов влияют многие факторы, такие как тип клеток, тип поверхности, на которую помещен сфероид, добавление в питательную среду различных веществ и др.

Для исследования кинетики распластывания сфероиды помещают на дно лунок культурального планшета из адгезивного пластика. Планшет инкубируют при температуре 37 °С во влажной атмосфере с 5% CO дней. Распластывание сфероидов оценивают визуально с помощью микроскопа, а также, помимо этого, в точках 0, 24, 48, 72, 96 и т.д. часов делают фотографии распластывания сфероидов. Полученные изображения обрабатывают в программе ImageJ, в которой измеряют площадь распластывания. На первом этапе путем порогового преобразования получают упрощенные изображения в градациях серого, после

в течение нескольких

чего определяют границы сфероидов и измеряют площадь распластывания в пикселях квадратных. Значения площадей могут быть переведены в микрометры квадратные путем сравнения с размерной шкалой.

Распластывание сфероидов из раковых клеток можно использовать для оценки инвазивности опухолей, а также для тестирования противоопухолевых препаратов (рис. 5.1) [14]. Сфероиды помещают в гидрогель или на адгезивную поверхность, после чего оценивают площадь миграции клеток.

Рис. 5.1. Оценка распластывания сфероидов из клеток

линии MG-63 (остеосаркома человека) в коллагеновом

гидрогеле после обработки доксорубицином [14]

Способность сфероидов распластываться на адгезивной поверхности может служить косвенным доказательством их жизнеспособности.

5.3. Реактивы, материалы и оборудование

См. лабораторную работу 1.

5.4. Порядок выполнения работы

1. Сформируйте сфероиды с помощью агарозных форм

(см. лабораторную работу 1).

2. Поместите сфероиды на дно лунок культурального

планшета из адгезивного пластика.

3. Инкубируйте при температуре 37 °С во влажной атмосфере с 5% CO2 до тех пор, пока процесс распластывания сфероидов не будет завершен или монослой клеток не займет всю поверхность лунки планшета (обычно 72–96 ч).

4. Фотографируйте распластывание сфероидов в точках 0, 24, 48, 72 и 96 ч (можно чаще) с помощью инвертированного микроскопа, оснащенного цифровой камерой.

5. Обработайте полученные фотографии в программе ImageJ. Измерьте площадь распластывания.

5.1. Запустите программу ImageJ.

5.2. Откройте файл с изображением распластывающегося сфероида (File  Open  …).

5.3. С помощью инструмента Freehand selections выделите зону распластывания вокруг сфероида (изображение значка Freehand selections на панели инструментов и пример выделения зоны распластывания показаны на рис. 5.2).

Рис. 5.2

5.4. Edit → Selection → Make Inverse.

5.5. Edit → Cut.

5.6. Edit  Invert.

5.7. Edit  Selection  Select None.

5.8. Image  Type  8-bit.

5.9. Image  Adjust  Threshold. Выберите режим, который лучше всего подходит для выделения зоны распластывания.

5.10. Analyze  Analyze Particles  OK.

5.11. В полученных результатах вас интересует значение параметра Area.

6. Постройте кривые зависимости площади распластывания от времени в любой программе (например, в Excel).

4.5. Требования к отчету о работе

Отчет должен содержать:

1) цель работы;

2) краткое изложение теории;

3) кривые зависимости площади распластывания сфероидов от времени.

Задачи

1. На основе данных из табл. 5.1 постройте графики зависимости площади распластывания сфероидов от времени (разные графики для сфероидов из разного количества клеток).

Таблица 5.1

Площади распластывания сфероидов в зависимости

от первоначального количества клеток в сфероиде и срока

культивирования

5000 клеток 10 000 клеток 20 000 клеток 40 000 клеток

Area,

День

μm

49 656 12 502 6 64 198 4227 6 97 203 8881 6 171 135 9854 6

808 079 192 707 6 732 304 128 482 6 814 912 48 993 6 912 780 218 136 6

2 492 239 248 484 6 2 199 365 372 746 6 2 415 274 190 846 6 2 953 189 514 429 6

7 221 439 286 873 6 7 140 463 170 563 6 7 690 831 335 523 6 8 228 458 339 587 6

SD N

Area,

μm

SD N

Area,

μm

SD N

Area,

μm

SD N

Примечание. Аrea – площадь распластывания сфероида. SD –

стандартное отклонение. N – количество сфероидов.

2. На основе данных из табл. 5.1 постройте графики зависимости площади распластывания сфероидов от количества клеток (разные графики для разных сроков культивирования).

Лабораторная работа 6

КАЧЕСТВЕННАЯ ОЦЕНКА

ЖИЗНЕСПОСОБНОСТИ СФЕРОИДОВ

С ПОМОЩЬЮ ТЕСТ-СИСТЕМЫ

НА ЖИВЫЕ И МЕРТВЫЕ КЛЕТКИ

(2 часа)

6.1. Цель работы

Научиться оценивать жизнеспособность сфероидов каче-

ственным методом путем окраски на живые и мертвые клетки.

6.2. Теоретическое введение

Наиболее часто для качественной оценки жизнеспособности сфероидов используются тест-системы на живые и мертвые клетки [1, 2, 15]. Они производятся разными компаниями, но основаны на одном и том же принципе. Гибель клеток сопровождается потерей целостности мембраны. Соответственно, клетки внутри сфероида окрашиваются с помощью специальных красителей, взаимодействующих либо только с мертвыми, либо только с живыми клетками. После этого меченые клетки можно визуально обнаружить с помощью флуоресцентного микроскопа. Для окраски живых клеток используют кальцеин-AM, ацетоксиметиловый эфир кальцеина, который представляет собой нефлуоресцентный краситель, способный проникать в живые клетки. Внутриклеточные эстеразы удаляют ацетометоксигруппу, превращая его в кальцеин, что сопровождается испусканием зеленой флуоресценции. В мертвых клетках активные эстеразы отсутствуют, поэтому происходит окрашивание только живых клеток. Для окраски мертвых клеток используют пропидий йодид или гомодимер этидия, представляющие собой ядерные красители, которые не могут проходить через клеточную мембрану. Они интеркалируют с двойной спиралью ДНК мертвых клеток, излучая красную флуоресценцию (рис. 6.1).

Кальцеин-АМ

Пропидий

йодид

Пропидий

йодид

Кальцеин-АМ

ДНК

Кальцеин

Пропидий

йодид

Кальцеин-АМ

Кальцеин

Кальцеин-АМ

Живая

клетка

Пропидий

йодид

Пропидий

йодид

Кальцеин-АМ

Пропидий

йодид

Кальцеин-АМ

ДНК

Кальцеин-АМ

ДНК

Кальцеин-АМ

Мертвая

клетка

Зелёная

флуоресценция

Красная

флуоресценция

Рис. 6.1. Принцип работы тест-системы на живые

и мертвые клетки

6.3. Реактивы, материалы и оборудование

Реактивы – см. лабораторную работу 1 + тест-система на живые и мертвые клетки.

Материалы – см. лабораторную работу 1 + 96-луночный культуральный планшет.

Оборудование – см. лабораторную работу 1 + флуоресцентный микроскоп.

6.4. Порядок выполнения работы

1. Сформируйте сфероиды с помощью агарозных форм

(см. лабораторную работу 1).

2. Перенесите необходимое количество сфероидов

в 96-луночный планшет по одному сфероиду в лунку.

3. Приготовьте рабочий раствор для окраски на живые

и мертвые клетки (см. инструкцию к тест-системе).

4. Отберите от сфероидов культуральную среду и дважды

промойте их натрий-фосфатным буфером.

5. Отберите натрий-фосфатный буфер и добавьте по 50 мкл рабочего раствора для окраски на живые и мертвые клетки к каждому сфероиду.

6. Инкубируйте в темноте при 37 °С в течение 15 мин.

7. Используя флуоресцентный микроскоп, оцените наличие живых (зеленая флуоресценция) и мертвых (красная флуоресценция) клеток в сфероидах.

6.5. Требования к отчету о работе

Отчет должен содержать:

1) цель работы;

2) краткое изложение теории;

3) флуоресцентные фотографии сфероидов после окраски на живые и мертвые клетки.

Задача

На рис. 6.2 представлены флуоресцентные фотографии сфероидов на разных сроках культивирования после их окраски на живые и мертвые клетки. Определите, на каком максимальном сроке культивирования, на ваш взгляд, имеет смысл использовать данные сфероиды, чтобы они не содержали некротических клеток в центре.

День 1 День 3

День 6 День 10

Рис. 6.2. Флуоресцентные изображения сфероидов,

окрашенных на живые и мертвые клетки c помощью

кальцеина-АМ и пропидий йодида

Лабораторная работа 7

КОЛИЧЕСТВЕННАЯ ОЦЕНКА

ЖИЗНЕСПОСОБНОСТИ СФЕРОИДОВ

С ПОМОЩЬЮ ТЕСТ-СИСТЕМЫ

CELLTITER-GLO 3D

(1–3 дня)

7.1. Цель работы

Научиться количественно оценивать жизнеспособность сфероидов с помощью тест-системы CellTiter-Glo 3D.

7.2. Теоретическое введение

Для количественной оценки жизнеспособности клеток в составе сфероидов удобно использовать тест-систему CellTiter-Glo 3D компании Promega (рис. 7.1) [1, 16].

O2, АТФ СO2, АМФ

НО

Люциферин

Рис. 7.1. Принцип работы тест-системы CellTiter-Glo 3D

COOH

Люцифераза

НО

Оксилюциферин

Свет

Данная тест-система основана на измерении содержания АТФ в АТФ-зависимой люциферазной реакции. Она содержит лизирующий буфер, фермент люциферазу и его субстрат люциферин. При добавлении тест-системы к сфероидам происходит лизирование клеток, внутриклеточный АТФ выходит в раствор, что запускает реакцию окисления люциферина в оксилюциферин, сопровождаемую люминесценцией, сигнал которой пропорционален количеству живых клеток. Преимуществами данной тест-системы является высокая скорость

анализа, его простота, очень высокая чувствительность, хорошая воспроизводимость данных. Однако следует учитывать одно существенное ограничение этого анализа. Предполагается, что уровень АТФ в клетках, подвергающихся апоптозу, снижен. В действительности предпосылкой апоптотической гибели клеток является повышение уровня цитозольного АТФ. Таким образом, для клеток, которые только вступают в апоптоз, этот анализ работает некорректно.

Простым и нетоксичным методом определения жизнеспособности клеток внутри сфероидов является анализ с помощью резазурина [1, 17]. Резазурин представляет собой слабофлуоресцентный синий краситель, который подвергается необратимому восстановлению до розового флуоресцентного резоруфина живыми метаболически активными клетками (рис. 7.2).

–

НО

синий, не флуоресциирует

Рис. 7.2. Принцип работы тест-системы на основе

Резазурин

резазурина

НО

розовый, флуоресциирует

ОО

Резоруфин

Количественный анализ жизнеспособности можно проводить либо на основе флуоресцентного сигнала, либо на основе изменения оптической плотности. Это позволяет использовать данный реагент как в присутствии автофлуоресцирующих, но бесцветных соединений, так и в присутствии цветных соединений, не обладающих автофлуоресценцией. Основные преимущества резазурина заключаются в том, что он относительно дешев, дает стабильный сигнал и не требует лизиса клеток. Однако данный реагент менее чувствительный, чем тест-система CellTiter-Glo 3D.

<<< < Предыдущая 1 2 34 / 54 5 > Следующая >>>

Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]