Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Формирование и характеризация тканевых сфероидов. Лабораторный практикум
.pdf
Планшеты с низкоадгезивным покрытием
1000 кл/сф 3375 кл/сф 8000 кл/сф 16 000 кл/сф 27 000 кл/сф
1200
1100
1000
900
800
700
600
500
400
Диаметр, мкм
300
200
100
0
12369 12369 12369 12369 12369
День культивирования
Агарозные формы
1000 кл/сф 3375 кл/сф 8000 кл/сф 16 000 кл/сф 27 000 кл/сф
900
800
700
600
500
400
300
Диаметр, мкм
200
100
0
12369 12369 12369 12369 12369
День культивирования
Рис. 3.3. Зависимости диаметров сфероидов из клеток
линии HEK293, сформированных разными методами,
от срока культивирования [8]
Измерение диаметров сфероидов можно использовать для
оценки активности цитостатиков. Так, сфероиды из клеток
линий HEK293 и Vero CCL-81 были обработаны противоопухолевыми препаратами в течение 3 дней, после чего были измерены их диаметры и построены кривые зависимости диаметров сфероидов от концентрации препаратов. На основании
построенных кривых были рассчитаны значения полуингибиторной концентрации IC50 для каждого препарата [1, 9].
21
3.3. Реактивы, материалы и оборудование
См. лабораторную работу 1.
3.4. Порядок выполнения работы
1. Сформируйте сфероиды с помощью агарозных форм
(см. лабораторную работу 1).
2. Ежедневно фотографируйте сфероиды в одно и то же
время на протяжении 5 дней с помощью инвертированного
микроскопа, оснащенного цифровой камерой.
3. Обработайте полученные изображения в программе
ImageJ. Для этого путем порогового преобразования получите упрощенные изображения в градациях серого, после
чего определите границы сфероидов и измерьте минимальный диаметр Ферета (MinFeret) в пикселях. Затем значения
диаметров переведите в микрометры путем сравнения с размерной шкалой. Для оценки формы сфероидов используйте
параметр округлости (Roundness).
3.1. Установите программу ImageJ на компьютер.
3.2. Запустите программу.
3.3. Откройте файл с изображением сфероида (File
Open …).
3.4. Image Type 8-bit.
3.5. Image Adjust Threshold. Выберите режим, который лучше всего подходит для выделения сфероида. Это может быть Default, Huang и т.д. Например, на рис. 3.4 режим
Yen подходит лучше, чем режим Huang.
Рис. 3.4
22
3.6. С помощью инструмента Straight line нарисуйте линию, соответствующую по длине размерной шкале на изображении.
3.7. Analyze Set scale. В разделе Known distance ука-
жите размер в микрометрах (в примере выше это 500 мкм).
Для того чтобы этот размер автоматически учитывался во
всех последующих измерениях (до закрытия программы),
поставьте галочку в поле Global.
3.8. Analyze Analyze Particles OK. Прежде, чем на-
жать кнопку ОK, поставьте галочку в разделе Display results,
чтобы увидеть результаты обработки данных. В разделе Size
можно ограничить размеры частиц, которые будут обрабатываться программой, чтобы она не считала все мелкие точки,
а измеряла только сфероид(ы). Значения остальных полей вы
можете узнать, прочитав инструкцию к программе.
3.9. В полученных результатах вас интересует значение
параметра MinFeret (это диаметр сфероида) и Round (это
округлость сфероида). В том случае, если эти параметры
не рассчитываются, нажмите Results Set Measurements
и в появившемся окне отметьте галочками те параметры, которые вас интересуют. После этого закройте окно результатов и заново выполните пункт 3.8.
4. Постройте зависимость диаметров и округлостей сфероидов от времени в любой доступной программе (например,
в Excel).
3.5. Требования к отчету о работе
Отчет должен содержать:
1) цель работы;
2) краткое изложение теории;
3) диаграммы зависимости диаметров и округлостей сфероидов от времени.
23
Задачи
1. На основе данных из табл. 3.1 постройте графики зависимости диаметров сфероидов от времени (разные графики
для сфероидов из разного количества клеток).
2. На основе данных из табл. 3.1 постройте графики зависимости диаметров сфероидов от количества клеток (разные
графики для разных сроков культивирования).
Таблица 3.1
Диаметры сфероидов в зависимости от первоначального количества
клеток в сфероиде и срока культивирования
2000 клеток 4000 клеток 8000 клеток 16 000 клеток
День
Примечание. D – диаметр сфероида. SD – стандартное отклонение. N –
количество сфероидов.
D,
SD N D, μm SD N D, μm SD N
μm
1 273,6 14,5 81 309,1 22,0 81 353,6 13,2 81 407,8 16,5 81
3 269,1 15,5 81 301,8 15,1 81 340,9 13,0 81 394,2 16,9 81
7 253,0 12,9 81 289,1 21,9 81 326,7 19,1 81 374,0 17,0 81
10 237,7 14,2 81 272,3 18,3 81 302,8 15,4 81 352,3 15,8 81
14 221,8 12,7 81 263,4 20,7 81 286,3 16,8 81 328,9 17,2 81
D,
μm
SD N
24
Лабораторная работа 4
АНАЛИЗ КИНЕТИКИ СЛИЯНИЯ
СФЕРОИДОВ
(2 дня)
4.1. Цель работы
1. Научиться измерять морфометрические параметры,
характеризующие кинетику слияния сфероидов, в программе ImageJ.
2. Научиться строить кривые зависимости угла слияния
и длины контакта от времени.
4.2. Теоретическое введение
Слияние тканей – это фундаментальный биологический
процесс, который лежит в основе использования сфероидов
в качестве строительных блоков для биофабрикации тканевых и органных конструктов. При непосредственном контакте двух или более сфероидов происходит их постепенное
слияние друг с другом и образование единого конструкта.
Для количественной оценки процесса слияния сфероидов
была предложена схема, основанная на формировании дублетов сфероидов и последующем измерении кинетики изменения трех параметров: угла слияния, длины контакта
и двойного диаметра (рис. 4.1) [1, 2, 10]. В процессе культивирования угол слияния должен расти и постепенно достигать 180°, что свидетельствует о полном слиянии сфероидов.
Длина контакта также должна постепенно расти и достигать
исходного диаметра сфероидов, а двойной диаметр должен
постепенно уменьшаться.
Пары сфероидов помещают в ячейки планшета с низкоадгезивным покрытием так, чтобы сфероиды находились
в непосредственном контакте друг с другом. Планшет инкубируют при температуре 37 °С во влажной атмосфере с 5%
в течение нескольких дней до тех пор, пока процесс
CO
2
25
слияния сфероидов не будет завершен. Слияние сфероидов
оценивают визуально с помощью микроскопа, а также, помимо этого, в точках 0, 2, 4, 6 и 24 ч делают фотографии слияния сфероидов. Полученные изображения после этого обрабатывают в программе ImageJ (NIH, Bethesda, MD, USA),
в которой измеряют угол слияния – угол, образуемый двумя
сливающимися сфероидами; длину контакта, равную расстоянию между точками слияния двух сфероидов, и двойной
диаметр, представляющий собой сумму двух диаметров сливающихся сфероидов.
Угол слияния
Длина контакта
Двойной
диаметр
Рис. 4.1. Морфометрические параметры для оценки
кинетики слияния сфероидов
Изучение кинетики слияния сфероидов может быть использовано для анализа уровня созревания ткани in vitro
[11]. Было изучено слияние сфероидов из дермальных фибробластов мышей дикого типа и мышей с дефицитом периостина. В качестве измеряемых параметров были выбраны
двойной диаметр и длина контакта. Было установлено, что
сфероиды из фибробластов периостин-дефицитных мышей
сливались быстрее, чем сфероиды из фибробластов нормальных мышей. Известно, что периостин индуцирует фибриллогенез коллагена, способствуя созреванию ткани. Таким образом, сфероиды, сформированные из фибробластов
периостин-дефицитных мышей, обладали более низкой
тканевой когезивностью и являлись менее зрелыми, что
26
привело к их более быстрому слиянию. Полученные результаты продемонстрировали, что исследование кинетики слияния сфероидов может быть использовано в качестве метода оценки способности различных факторов индуцировать
созревание ткани.
Способность сфероидов к эффективному слиянию может
также рассматриваться как косвенный показатель жизнеспособности сфероидов (рис. 4.2) [12].
400
300
200
100
Длина контакта, мкм
0
0 24 48 72 96 120 144 168
120
100
80
60
40
Двойной диаметр, %
20
0
0 24 48 72 96 120 144 168
Время, часы
3+
0 мМ Gd
50 мМ Gd
250 мМ Gd
Время, часы
3+
3+
0 мМ Gd
50 мМ Gd
250 мМ Gd
3+
3+
200
150
`00
Угол слияния, q
50
3+
0
120
100
80
60
40
Жизнеспособность, %
20
0
0 24 48 72 96 120 144 168
0 0 мМ Gd
Рис. 4.2. Влияние различных концентраций гадовиста
(Gd3+) на кинетику слияния и жизнеспособность
сфероидов из хондроцитов барана [12]
Время, часы
3+
50 мМ Gd
0 мМ Gd
50 мМ Gd
250 мМ Gd
3+
250 мМ Gd
3+
3+
3+
3+
Так, например, при обработке сфероидов из хондроцитов барана двумя разными концентрациями парамагнитного вещества, обладающего цитотоксическими свойствами, было показано, что концентрация 50 мМ практически
27
не влияет на слияние сфероидов, в то время как концентрация 250 мМ блокирует слияние. Анализ жизнеспособности сфероидов показал, что концентрация 50мМ снижает
жизнеспособность клеток в сфероидах до 90% по сравнению с контролем, в то время как концентрация 250 мМ –
до 27%.
4.3. Реактивы, материалы и оборудование
Реактивы – см. лабораторную работу 1.
Материалы и оборудование – см. лабораторную работу 1
+ планшеты с низкоадгезивным покрытием.
4.4. Порядок выполнения работы
1. Сформируйте сфероиды с помощью агарозных форм
(см. лабораторную работу 1).
2. Поместите пары сфероидов в ячейки планшета с низкоадгезивным покрытием так, чтобы сфероиды находились
в непосредственном контакте друг с другом.
3. Инкубируйте при температуре 37 °С во влажной атмос-
фере с 5% CO2 до тех пор, пока процесс слияния сфероидов
не будет завершен (обычно 24 ч).
4. Фотографируйте слияние сфероидов в точках 0, 2, 4,
6 и 24 ч (можно чаще) с помощью инвертированного микроскопа, оснащенного цифровой камерой.
5. Обработайте полученные фотографии в программе
ImageJ. Измерьте угол слияния – угол, образуемый двумя
сливающимися сфероидами, и длину контакта, равную расстоянию между точками слияния двух сфероидов.
5.1. Запустите программу ImageJ.
5.2. Откройте файл с изображением сливающихся сфероидов (File Open …).
5.3. С помощью инструмента Angle tool выделите угол
между двумя сливающимися сфероидами (изображение
значка Angle tool на панели инструментов и пример выделения угла показаны на рис. 4.3).
28
Рис. 4.3
5.4. Analyze Measure.
5.5. Повторите п. 5.3 и 5.4. для второго угла слияния.
5.6. С помощью инструмента Straight line выделите дли-
ну контакта (изображение значка Straight line на панели инструментов и пример выделения длины контакта показаны
на рис. 4.4).
Рис. 4.4
29
5.7. Analyze Measure.
6. Постройте кривые зависимости угла слияния и длины контакта от времени в любой программе (например,
в Excel).
4.5. Требования к отчету о работе
Отчет должен содержать:
1) цель работы;
2) краткое изложение теории;
3) кривые зависимости угла слияния и длины контакта
от времени.
Задачи
1. На основе данных из табл. 4.1 постройте графики зависимости угла слияния сфероидов от времени для сфероидов из разного количества клеток.
Таблица 4.1
Углы слияния сфероидов в зависимости от первоначального
количества клеток в сфероиде
Часы
0,5 30,4 1,6 10 20,2 12,7 10 19,5 8,8 10
2 88,5 21,5 10 78,5 26,3 10 38,0 9,3 10
4 118,6 21,4 10 99,8 29,0 10 61,5 18,7 10
6 143,8 19,3 10 128,9 11,7 10 85,0 14,2 10
24 168,2 7,9 10 170,3 4,0 10 141,5 13,4 10
Примечание. Angle – угол слияния сфероидов. SD – стандартное
отклонение. N – количество сфероидов.
1000 клеток 3375 клеток 27 000 клеток
Angle, ° SD N Angle, ° SD N Angle, ° SD N
2. На основе данных из табл. 4.2 постройте графики зависимости угла слияния сфероидов от времени для сфероидов на разных сроках культивирования.
30
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]