Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Сельскохозяйственная биотехнология. Лабораторный практикум
.pdf
МИНИСТЕРСТВО НАУКИ И ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ
РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ
ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ
«САМАРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ТЕХНИЧЕСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ»
К а ф е д р а «Технологии пищевых производств и биотехнологии»
СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ
БИОТЕХНОЛОГИЯ
Лабораторный практикум
Самара
Самарский государственный технический университет
2020
1
Печатается по решению ученого совета СамГТУ, 2020.
УДК 579(076.5):63
ББК 28.07я73
С 298
Сельскохозяйственная биотехнология:
Н.В. Кривов.
– Самара: Самар. гос. техн. ун-т, 2020. – 68 с.
лаборат. практикум / Сост.
Описаны основные методы стерилизации при работе с культурой изолированных клеток и тканей; приготовления питательных сред для культивирования
изолированных клеток и тканей растений; получения культур тканей из различных растительных объектов; выделения и культивирования апикальных меристем картофеля, а также изолированных зародышей злаковых культур; изучения влияния регуляторов роста на прорастание семян пшеницы, фитогормонов
на рост и укоренение черенков декоративных и садовых древесных культур.
Рассматривается схема получения гибридных семян моркови на основе ядерноцитоплазматической мужской стерильности.
Предназначен для студентов бакалавриата, обучающихся по направлению
19.03.01 «Биотехнология».
Рецензенты
: канд. фарм. наук, доцент
канд. биол. наук, доцент
З.Е. Мащенко
А.А. Семенов
,
УДК 579(076.5):63
ББК 28.07я73
С 298
© Н.В. Кривов, составление, 2020
© Самарский государственный
технический университет, 2020
2
ВВЕДЕНИЕ
«Сельскохозяйственная биотехнология» является одной из специальных дисциплин, которую изучают студенты, обучающиеся по
направлению 19.03.01 «Биотехнология» (уровень бакалавриат) профиля «Биотехнология функциональных продуктов питания и биологически активных веществ».
Методические указания к лабораторным занятиям для бакалавров
составлены с учетом часов, отведенных учебным планом на лабораторные занятия. Программой предусмотрено выполнение лабораторных занятий по основным разделам курса для закрепления теоретических знаний. В ходе выполнения лабораторных работ студенты получают навыки работы с культурой тканей, осваивая основные методы
стерилизации при работе с культурой изолированных клеток и тканей; приготовления питательных сред для культивирования изолированных клеток и тканей растений; получения культур тканей из различных растительных объектов, микроклональное размножение моркови для интеграции в генетико-селекционную схему создания F1гибридов на основе самонесовместимости; выделения и культивирования апикальных меристем картофеля, а также изолированных зародышей пшеницы; изучения влияния регуляторов роста на прорастание семян пшеницы, фитогормонов на рост растений и укоренение
черенков древесных культур.
Допуск студентов к занятиям проводится по теоретической части
изучаемой тематики курса. Каждая работа имеет задание, требования
по оформлению, контрольные вопросы. Качество выполнения занятий контролируется путем устных или письменных опросов.
3
ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 1
Изучение методов стерилизации при работе
с культурой изолированных клеток и тканей
Теоретические основы
Культура клеток и тканей растений может использоваться в двух
основных направлениях:
1) размножение или поддержание жизни у неизмененных
по сравнению с донорами клеток, тканей, растений;
2) целенаправленное воздействие на изменение генетического
статуса клеток и отбор в селективных условиях нужных вариантов.
Возможности культуры изолированных клеток и тканей растений
весьма обширны:
1) получение вторичных метаболитов, продуцируемых отдельными клетками и тканями некоторых полезных растений (алкалоидов, глюкозидов, стероидов и т.д.), используемых для производства
лекарств;
2) клеточная и тканевая селекция форм с полезными хозяйственными свойствами;
3) генетическое улучшение сельскохозяйственных растений;
4) ускоренное (микроразмножение) ценных и уникальных геноти-
пов и поддержание жизнеспособности ослабленных клеток и тканей;
5) освобождение (оздоровление) посадочного материала от ви-
русной инфекции;
6) сохранение генофонда в условиях криоконсервации [2, 12].
С использованием методов культивирования также решается
большое число теоретических проблем, в том числе:
- особенности старения растительной клетки;
- процессы цитодифференцировки и морфогенеза;
- роль фитогормонов, углеводов, витаминов, минеральных ве-
ществ при каллусогенезе, органогенезе, морфогенезе;
- взаимоотношения клеток высших растений с клубеньковыми
бактериями и микоризными грибами;
4
- механизмы устойчивости растений к неблагоприятным факто-
рам среды: абиотическим (засолению, кислой среде, низким температурам и т.д.), биотическим (патогенам разного происхождения, вызывающим болезни растений);
- регуляция вторичного обмена;
- механизмы опухолеобразования;
- механизмы сомаклональной изменчивости;
- популяционные взаимоотношения в клеточной культуре [2].
Одним из основных условий успешного культивирования изолированных органов, тканей, клеток и протопластов является соблюдение строгой стерильности, поскольку на искусственных питательных
средах хорошо развиваются и микроорганизмы, что представляет
двойную опасность. Во-первых, в результате жизнедеятельности
микроорганизмов может существенно измениться состав питательных сред, во-вторых, изолированные от растения ткани, клетки,
в особенности протопласты, легко повреждаются микроорганизмами.
Поэтому все опыты проводят в стерильных условиях. Стерилизуют
ламинар-бокс, инструменты, посуду, растительный материал, питательные среды, ватные пробки и все другие материалы [1].
Стерилизация ламинар-бокса
(шкафа). Ламинар-боксы предназначены
для выполнения различных работ с культурой изолированных клеток и тканей,
требующих стерильности (рис. 1.1).
Стерильность обеспечивается с помощью бактериальных фильтров, установленных в ламинар-боксе, через которые нагнетается воздух. За 2 часа до
начала работы ламинар-бокс облучают
бактерицидными ультрафиолетовыми
лампами. Предварительно в ламинаре
размещают спиртовую или газовую го-
5
Рис. 1.1. Ламинарный шкаф
релки, спички, фарфоровый стакан с 96 %-м спиртом и стерильной
водой, а при вычленении меристем – и бинокулярную лупу. Внутреннюю поверхность ламинара, спиртовку, лупу, пробирки с питательной средой протирают 70 %-м спиртом.
Работающий должен вымыть руки с мылом, надеть стерильный
халат, завязать волосы стерильной марлевой косынкой. Непосредственно перед началом работы в ламинар-боксе нужно протереть руки спиртом [1].
Стерилизация посуды. В начале посуду тщательно моют с ис-
пользованием детергентов, а также раствора двухромовокислого калия в серной кислоте (хромпик). Вымытую посуду ополаскивают дистиллированной водой и высушивают в сушильном шкафу. Чтобы
избежать заражения простерилизованных предметов из воздуха, перед стерилизацией их заворачивают в оберточную бумагу (у стаканов
и колб достаточно обернуть только горлышко).
Затем посуду помещают в сушильный шкаф и прогревают при
160 оС в течение 2 ч (с момента установки нужной температуры). За это
время погибают не только бактерии, но и их споры. Температура выше
175 оС недопустима, так как при этом ватные пробки буреют, а бумаж-
ные обертки становятся ломкими. Еще более строгой стерилизации
можно добиться в автоклаве (рис. 1.2), поскольку влажный пар (120–
125 оС) под давлением губителен для микроорганизмов и их спор.
Посуду (стаканы с крышками, чашки Петри, пипетки) заворачивают в фольгу или оберточную бумагу, сверху – в целлофан; верхнюю часть градуированных пипеток закрывают ватой, каждую заворачивают в бумагу. Автоклавируют под давлением 2 атм в течение
25–30 мин [16].
Стерилизация инструментов. Предварительная стерилизация инструментов (скальпелей, пинцетов, игл и т.д.) заключается в нагревании
сухим горячим жаром в сушильном шкафу в течение 2 часов при температуре 140 оС. Шприцы, ножницы, пробочные сверла удобнее кипятить. Металлические предметы нельзя автоклавировать: под действием
пара они ржавеют и тупятся. Непосредственно перед работой и в ее
6
процессе инструменты (пинцеты, скальпели, микробиологические петли) еще раз стерилизуют, помещая их в фарфоровый стакан с 96 %-м
этиловым спиртом и обжигая в пламени горелки. Стерильный инструмент используют только для одной манипуляции. Очень тонкие инструменты (иглы, кусочки лезвий) могут терять свои свойства при обжигании, поэтому их стерилизуют, погружая в спирт [3].
Рис. 1.2. Схема автоклава:
1 – стерилизационная камера; 2 – кран для выхода воздуха; 3 – манометр;
4 – предохранительный клапан; 5 – водопаровая камера; 6 – воронка для заполнения
автоклава водой; 7 – отверстия для поступления пара в стерилизационную камеру;
8 – крышка автоклава; 9 – подставка для размещения стерилизуемых материалов
Стерилизация материалов. Вату, марлю, ватные пробки, бу-
мажные «матрасики», фильтровальную бумагу, халаты, косынки стерилизуют в автоклаве под давлением 2 атм в течение 25–30 мин.
Стерилизация растительного материала. Для стерилизации
семян, апексов, кусочков ткани, выделенных из различных частей
растения, применяют следующие растворы: диацид, пергидроль (перекись водорода), хлорамин, гипохлорит натрия или кальция [1].
7
Диацид готовят, растворяя отдельно 330 мг этанолмеркурхлорида и 660 мг цетилпиридиния хлорида в горячей воде (около 300 мл),
затем их смешивают и доводят объем жидкости до 1 л, добавляют несколько капель детергента «Твин-80», хранят в плотно закрытой колбе в темноте. Перед стерилизацией ткань растения предварительно
очищают. Корнеплоды, клубни, толстые стебли растений тщательно
моют щеткой с мылом в теплой проточной воде, промывают дистиллированной водой и опускают на несколько секунд (семена – на 1–
2 мин) в 70 %-й этиловый спирт. Обработка тканей этанолом повышает эффект основного стерилизующего раствора. Затем растительные объекты многократно прополаскивают в стерильной воде.
Пергидроль рекомендуется использовать для фасоли, люпина,
подсолнечника (с очищенной кожурой) и др. Продолжительность
стерилизации семян пергидролем – 30 мин, для меристем и кусочков
тканей требуется примерно в 2 раза меньше времени.
Семена томатов, яблони, тыквы, бобов, табака ко времени созревания заключены в мясистые, деревянистые или костянковидные покровы. Поэтому здоровые, с неповрежденной поверхностью плоды
этих культур достаточно тщательно промыть водой, затем – несколько раз спиртом, после чего в строго асептических условиях их разрезают. Стерильным пинцетом вынимают семена и помещают их в стерильные чашки Петри для проращивания [16].
Стерилизация питательных сред. Разлитые в пробирки пита-
тельные среды закрывают ватными пробками, заворачивают в целлофан и автоклавируют при температуре 120 оС и давлении 1 атм в течение 20 мин.
Холодная стерилизация. Органические жидкости, не вынося-
щие нагревания (например, гиббереллины, аскорбиновая кислота, кокосовое молоко), освобождаются от бактерий при пропускании через
стерильные мелкопористые бактериальные фильтры с диаметром пор
0,45 мкм [1, 2].
8
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Цель работы: освоить методы стерилизации посуды, инструмен-
тов, материалов, растительного материала, питательных сред, а также
холодной стерилизации.
Материалы, оборудование, реактивы: зерновки пшеницы;
чашки Петри (5 шт.) с фильтровальной бумагой; стаканы химические
вместимостью 100 мл; колба вместимостью 1 л с дистиллированной
водой; растворы регуляторов роста (корневин, гетероауксин и дистиллированная вода); пинцеты; скальпели; целлофан; ножницы; бумага фильтровальная; порошок хлорамина.
Последовательность выполнения работы
Студентам необходимо простерилизовать инструменты, посуду
и растворы регуляторов роста, необходимые для проведения работ по
введению в культуру in vitro зерновок озимой пшеницы.
1. Завернуть в плотную бумагу и простерилизовать в автоклаве
под давлением 2 атм в течение 25–30 мин при температуре 160 оС
чашки Петри с фильтровальной бумагой, химические стаканы вместимостью 100 мл (2 шт.), бумажные «матрасики».
2. Подвергнуть предварительной стерилизации в сушильном
шкафу скальпели и пинцеты. Перед помещением в сушильный шкаф
завернуть их в плотную бумагу.
3. Для получения стерильной воды и растворов регуляторов роста
налить их в колбы необходимого объема, закрыть ватной пробкой
или фольгой, сверху – плотной бумагой. Автоклавировать при давлении 1 атм в течение 20 мин.
4. Отобрать 110–120 здоровых семян, промыть их водопроводной
и дистиллированной водой.
5. Приготовить стерилизующий (10 %-й) раствор хлорамина путем добавления к 180 мл дистиллированной воды 20 г хлорамина, после чего на магнитной мешалке тщательно перемешать.
9
6. Семена погрузить в стерилизующий раствор и стерилизовать в
течение 30 мин, перемешивая на магнитной мешалке. Все последу-
ющие работы выполнять в условиях ламинар-бокса!
7. Семена промыть стерильной водой три раза. В четыре стерильные чашки Петри поместить по 20 семян озимой пшеницы, после чего чашки подписать и при помощи пипетки залить в нее 5 мл соответствующего раствора регулятора роста.
Чашка Петри № 1 – контроль. Дистиллированная вода.
Чашка Петри № 2 – раствор корневина.
Чашка Петри № 3 – раствор гетероауксина.
Чашка Петри № 4 – растворы корневин + гетероауксин.
8. Чашки с семенами поместить на проращивание в термостат на
7 дней при температуре 25 оС, после чего необходимо проанализировать полученные результаты.
Получаемые результаты
Студентам необходимо оценить эффект от стерилизующих мероприятий по степени зараженности семян (визуально – наличие или
отсутствие) микроорганизмами, процент всхожести и жизнеспособность семян.
Содержание отчета
Студентам необходимо ознакомиться с представленным теоретическим материалом и экспериментальной частью. Провести все требуемые исследования, оформить отчет с указанием цели работы, основных
теоретических положений, а также описанием последовательности выполнения работы и полученных результатов. Сделать выводы об эффективности проведенных стерилизующих мероприятий.
Контрольные вопросы
1. Как проводят стерилизацию ламинар-бокса?
2. Как проводят стерилизацию инструментов?
3. Как проводят стерилизацию посуды?
4. Как проводят стерилизацию питательных сред?
5. Как проводят стерилизацию растительного материала?
10
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]