Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Сельскохозяйственная биотехнология. Лабораторный практикум
.pdf
ганов зародыша или молодого проростка. Для их преодоления используется шунтирование нормального развития, его замена получением гибридной каллусной ткани из живых тканей проростка или зародыша и регенерация растений из каллусных клеток.
Выращивание зародышей на искусственной питательной среде
называется эмбриокультурой. В зависимости от стадии развития могут
быть изолированы недостаточно дифференцированные или вполне
сформировавшиеся зародыши. Среда для выращивания зрелого зародыша может быть простой, без добавок физиологически активных веществ. Для культивирования недифференцированных зародышей требуются более сложные питательные среды, содержащие не только витамины и стимуляторы роста, но и дополнительные трофические факторы (набор аминокислот, необходимые сахара, осмотики типа сорбита
и маннита, растительные экстракты неопределенного состава).
Преодоление постгамной несовместимости, обусловленной генетическими причинами, как уже отмечалось, осуществляется путем
введения промежуточного этапа получения гибридного каллуса и
растений-регенерантов на его основе. Этот подход впервые был применен для получения гибридных растений табака при межвидовом
скрещивании Nicotiana tabacum с диким видом Nicotiana occidentalis.
В результате этого скрещивания удалось получить гибридные семена,
но проростки гибли на стадии семядолей из-за отмирания первичного
корня и остановки роста. Индукция образования каллусной ткани из
семядолей и гипокотилей гибридных проростков, а затем и органогенеза в каллусах позволила получить сотни гибридных растений [11].
Каллусная ткань из гибридных растений может также служить
для получения вариантных форм. Так, из одного гибридного зародыша, возникшего при скрещивании ячменя и пшеницы, было получено
более сотни регенерантов. У половины из них отмечались различия
по морфологии и окраске колоса, длине остей и другим признакам,
что дало основания считать их сомаклональными вариантами.
Таким образом, практические аспекты использования метода эмбриокультуры заключаются в следующем:
31
- возможность получения межвидовых и межродовых гибридов;
- сохранение важного для селекции материала путем культиви-
рования in vitro изолированных семяпочек и потерявших всхожесть
семян;
- сокращение длительного селекционного процесса путем уско-
рения in vitro прохождения жизненного цикла растения;
- получение из гибридной каллусной ткани сомаклональных ва-
риантов;
3) устранение влияния эндосперма на проявление генетических
потенций зародыша.
Из оплодотворенной яйцеклетки, или зиготы, путем последовательных делений развивается зародыш, из оплодотворенной цен-
тральной клетки или клетки зачатка эндосперма развивается эндо-
сперм (рис. 5.2).
Рис. 5.2. Двойное оплодотворение и образование семени [17]
32
После слияния спермия с яйцеклеткой, т.е. мужской и женской
гаплоидных гамет, в оплодотворенной яйцеклетке восстанавливается
диплоидное число хромосом. Первичное ядро эндосперма, являясь
обычно продуктом слияния трех ядер – двух полярных и одного
спермия, имеет триплоидное число хромосом. В редких случаях, ко-
гда эндосперм образуется без оплодотворения, его клетки имеют ди-
плоидное число хромосом. После оплодотворения яйцеклетка и центральная клетка зародышевого мешка становятся способными к активному развитию. Двойное оплодотворение отсутствует у всех архегониальных растений и свойственно лишь покрытосеменным [18].
Нарушение развития зародыша и эндосперма, которое может
быть преодолено культивированием зародыша на питательной среде.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Цель работы: освоение методики получения культуры изолиро-
ванных зародышей пшеницы; изучение результатов культивирования
изолированных зародышей пшеницы и подсчет количества регенерантов.
Материалы, оборудование, реактивы: набухшие зерновки ози-
мой пшеницы (ржи) ‒ замачиваются в воде в течение 24 ч до проведения работ; простерилизованные чашки Петри; стерильные бумажные «матрасики»; 3 %-й раствор хлорамина; дистиллированная вода;
стерильные стаканчики; скальпель; пинцеты.
Последовательность выполнения работы
Приготовить на магнитной мешалке 3 %-й раствор хлорамина.
В раствор поместить набухшие зерновки ржи. Время стерилизации ‒
30 мин при постоянном перемешивании.
Последующие манипуляции следует проводить в условиях ламинар-бокса. Семена промыть 3 раза в автоклавированной дистиллированной воде в стерильном стаканчике.
На стерильных «матрасиках», придерживая зерновку, вычленяют
зародыш, надавливая скальпелем в зоне щитка. После этого зародыш
33
необходимо поместить в чашку Петри с питательной средой МС.
Чашки Петри с эксплантами поместить в культуральную комнату.
Через 7, 14, 21 день отметить количество регенерировавших зародышей.
Получаемые результаты
Студенты готовят питательную среду, разливают ее по пробиркам и автоклавируют; подготавливают к занятию семена пшеницы
(ржи); в стерильных условиях извлекают зародыши и помещают их
на питательную среду; через 7, 14 и 21 день отмечают количество регенерировавших зародышей.
Содержание отчета
Студентам необходимо ознакомиться с представленным теоретическим материалом и экспериментальной частью. Произвести все
требуемые исследования, оформить отчет с указанием цели работы,
основных теоретических положений, а также описанием последовательности выполнения работы и полученных результатов.
Контрольные вопросы
1. Что такое эмбриокультура?
2. Каковы основные достоинства эмбриокультуры?
3. Где могут быть использованы растения-клоны?
4. Какова последовательность выполнения работы по получению изолиро-
ванных зародышей пшеницы?
5. Какой препарат используется для стерилизации семян?
34
ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 6
Количественное определение содержания белка
по альбумину методом Лоури
Теоретические основы
Метод основан на образовании окрашенных продуктов ароматических аминокислот с реактивом Фолина в сочетании с биуретовой
реакцией на пептидные связи. Метод характеризуется высокой чувствительностью (10–100 мкг белка в пробе).
Ha развитие окраски влияет большое количество веществ: компоненты буферных систем (трис-буфер в концентрации 0,2 мМ, глицилглицин), восстановители (цистеин, дитиотреитол в концентрации
0,01–0,4 мМ, аскорбиновая кислота), комплексоны (ЭДТА в концентрации 0,5 мМ), детергенты (тритон X100 в концентрации 0,1–0,2 %
вызывает выпадение осадка), сернокислый аммоний в концентрации
0,15 %, сахароза в концентрации 10 % и др.
В связи с этим при построении калибровочного графика для
определения белка по методу Лоури в растворитель для стандартного
белка необходимо включать все компоненты, содержащиеся в анализируемых пробах. B некоторых случаях целесообразно предварительное осаждение белков из растворов, например трихлоруксусной кислотой, с последующим растворением их в щелочных растворах или
очистка белковых растворов от низкомолекулярных компонентов путем диализа или гель-фильтрации на сефадексе G-25.
Интенсивность окраски комплекса, которая пропорциональна количеству белка в исследуемой пробе, измеряется спектрофотометрически.
Для исключения случайных ошибок, которые могут возникать
в процессе измерения, рекомендуется не ограничиваться одним измерением (готовят 2 ряда пробирок) [13].
При определении концентрации вещества в растворе следует соблюдать следующую последовательность в работе:
а) построение калибровочной кривой для данного вещества;
35
б) измерение оптической плотности исследуемого раствора и
определение концентрации вещества в растворе по калибровочной
кривой.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Цель работы: освоение метода определения содержания белка
по альбумину по Лоури.
Материалы, оборудование, реактивы:
- реактив № 1: 2 %-й раствор Na2CO3 в 0,1 М растворе NaOH;
- реактив № 2: 0,5 %-й раствор CuSO4х5H2O в 1 %-м цитрате
натрия;
- реактив № 3: готовится непосредственно перед работой:
15 мл реактива I + 0,3 мл реактива № 2;
- реактив № 4 ‒ реактив Фолина – Чокалтеу: 10 г
Na2Wo4 х 2H2O (перекристаллизованный) и 2,5 г Na2MoO4 х 2H20 по-
мещают в круглодонную колбу на 200–250 мл, приливают 70 мл воды
и хорошо перемешивают. K полученному раствору добавляют 5 мл
85 %-го раствора фосфорной кислоты и 10 мл концентрированной
HCl (x.ч.). Колбу присоединяют к обратному холодильнику (на шли-
фе), ставят на сетку и кипятят в течение 10 ч. Затем в раствор добавляют 15 г Li2SO4, 5 мл воды и одну каплю брома. Раствор перемешивают и нагревают для удаления брома. После охлаждения доводят
водой до 100 мл, фильтруют и разводят водой с таким расчетом, чтобы получился 1 М раствора кислоты (т.е. приблизительно вдвое).
Кислотность определяют титрованием разведенного в 10 раз реактива
0,1 н. щелочью в присутствии фенолфталеина. Реактив может храниться в темной склянке длительное время;
- реактив № 5: стандартный раствор белка, содержащий
0,25 мг в 1 мл раствора;
- реактив № 6: раствор белка концентрации Х; пробирки; кю-
веты; спектрофотометр.
36
Последовательность выполнения работы
Построение градуировочного графика. Для построения градуировочного графика используют ряд растворов бычьего альбумина с известными концентрациями. Для этого отвешивают 10 мг альбумина и
растворяют в 10 мл воды. Из этого раствора отбирают пипеткой 2 мл,
переносят в цилиндр вместимостью 50 мл и доводят водой до 10 мл.
Концентрация полученного исходного раствора белка – 200 мг/мл. Из
этого раствора готовят разбавленные растворы. Для этого наливают в
пробирки объемы белка и воды, указанные в табл. 7.1.
Пятая пробирка не содержит белка и служит контролем на реактивы. В шестую пробирку внести 0,4 мл раствора белка неизвестной
концентрации (белок куриного яйца) ‒ Х (табл. 7.1).
Таблица 7.1
Исходные концентрации, объемы стандартного раствора белка и воды
№
пробирки
Концентрация
р-ра белка,
(мг/мл)
Кол-во исходного
раствора белка, мл
Кол-во
H20, мл
Общий объем
исследуемой
пробы, мл
1 40 0,2 0,8 0,4
2 60 0,3 0,7 0,4
3 80 0,4 0,6 0,4
4 100 0,5 0,5 0,4
5 120 0,6 0,4 0,4
6 140 0,7 0,3 0,4
7 160 0,8 0,2 0,4
5(К) 0 0 0,4 0,4
6(Х) х 0,4 0 0,4
Примечание. Во все пробирки добавить по 2 мл реактива № 3, смесь тща-
тельно перемешать. Через 10 мин добавить 0,2 мл реактива № 4 Фолина – Чокалтеу. Реакционную смесь перемешать и оставить при комнатной температуре
на 30 мин.
Через 30 мин измеряют оптическую плотность каждого раствора на ФЭК
при длине волны 750 или 500 нм и строят градуировочный график, откладывая
по горизонтальной оси (абсциссе) известные концентрации, а по вертикальной
оси (ординате) соответственно значения оптической плотности (рис. 7.2).
37
Концентрация р-ра белка ( мг/мл)
180
160
140
120
100
80
60
40
20
оптическая плотность раствора
0
1 2 3 4 5 6 7
Рис. 7.2. Калибровочный график,
построенный по стандартным растворам белка
Пользуясь градуировочной кривой, определяют неизвестную
концентрацию белка в исследуемом растворе ‒ 6 (Х) из табл. 7.1, со-
ответствующую измеренному значению оптической плотности.
B случае предварительного осаждения белка к исследуемому раствору добавляют CCl3COOH из такого расчета, чтобы конечная концентрация ее была равна 3–4 %. Раствор тщательно перемешивают и
оставляют на 10–20 мин. Выпавший осадок белка отделяют центрифугированием и промывают 2 %-м раствором CCl3COOH. K осадку
добавляют 1–2 мл 1 М раствора щелочи и осторожно подогревают до
растворения осадка белка. Раствор белка количественно переносят в
мерную колбу вместимостью 50 мл, доводят водой до метки, тщательно перемешивают и проводят определение белка.
Получаемые результаты
Студенты готовят стандартный раствор белка, а также требуемые
разбавления, разливая их по пробиркам, затем определяют их оптическую плотность, строят градуировочную кривую и находят на ней
неизвестное значение белка.
38
Содержание отчета
Студентам необходимо ознакомиться с представленным теоретическим материалом и экспериментальной частью. Произвести все
требуемые исследования, оформить отчет с указанием цели работы,
основных теоретических положений, а также описанием последовательности выполнения работы и полученных результатов.
Контрольные вопросы
1. В чем состоит особенность определения содержания белка по Лоури?
2. Как построить градуировочный график?
3. Как готовят реактив Фолина – Чокалтеу?
39
ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 7
Определение различий в способе действия регуляторов роста
растений на прорастание семян злаковых культур
Теоретические основы
Цель работы: изучение действия регуляторов роста (абсцизовая
кислота (АБК), гиббереллин (ГК), 2,4-Д, ретардант хлорхолинхлорид
(ТУР)) на прорастание семян злаковых культур (пшеницы, ржи, тритикали, ячменя, овса).
Абсцизовая кислота относится к фитогормонам ингибирующего
действия. Ее присутствием определяется физиологический покой
в растительных организмах.
Гиббереллин – фитогормон стимулирующего действия, определяет линейный рост побегов (рис. 7.1).
Рис. 7.1. Реакция на хроническую обработку гиббереллином-3 носителя
\доминантной мутации кукурузы - Cg2 (cправа контроль обрабатывался
\дистиллированной водой). Обработка заключалась во введении 1 мл раствора
гиббереллина в дозе 83 мг на литр в воронку из листьев через два дня
на третий, начиная со стадии 2-х листьев [19]
40
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]