Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Сельскохозяйственная биотехнология. Лабораторный практикум
.pdf
В отдельных случаях укоренение побегов может осуществляться
в нестерильных условиях. В качестве вещества, индуцирующего ризогенез, используется ростовая пудра на основе ИУК или ИМК. Микропобеги размером 2 см и более отделяются друг от друга, и помещаются в емкость с водой для предотвращения подсыхания. Затем
нижний конец каждого обрабатывается ростовой пудрой и побеги
помещаются в субстрат для укоренения. Укоренение происходит через 2–3 недели, если температура поддерживается в пределах 25–
27 оС, освещенность – 2000–3000 люкс, а поверхность листочков по-
стоянно смачивается водой. Через 8–10 недель после постановки на
укоренение микрорастения готовы для пикировки.
1. Подбираем субстрат: лёгкий, влагоёмкий, воздушный, например перлит, крупный песок, кокосовое волокно. Каллус и корешки
сформируются только в богатой воздухом среде.
2. Нарезаем черенки длиной 10–15 см. Нижний срез косой, под
почкой. Верхний – ровный, в 1 см, над почкой. При желании можно
пробороздовать нижнюю часть каждого.
3. Погружаем нижние срезы (именно только срезы) на высоту
всего 1–2 мм (стимуляторы могут вызывать отмирание коры) в любой
стимулятор корнеобразования. Берем то, что подходит для укоренения именно древесно-кустарниковых пород, желательно с известным
действующим веществом: ИМК, НУК, ИУК гормональной природы.
Действуем по инструкции: или делаем раствор, или же обмакиваем
срезы в пудру.
4. Втыкаем черенки в горшочек практически на всю глубину. Над
поверхностью субстрата оставляем всего 1 почку.
5. Если храним в холодном подвале, то просто ставим горшочек
на сырую почву или на слой влажного песка; если – в холодильнике,
то помещаем контейнер в пакет, иначе агрегат вытянет из побегов
влагу и высушит черенки до смерти; 1 раз в месяц осматриваем и при
необходимости слегка увлажняем субстрат.
51
6. Весной, как только появится достаточно много солнца, и день
станет длиннее ночи (для этой породы это важно), ставим горшочек
на самое светлое окно и накрываем стеклянной банкой. Если в дне
горшочка есть хорошее дренажное отверстие, то перелить субстрат
будет сложно. Но, возможно, подсыхать он будет быстро, поэтому
нужно за этим следить. Увлажнять поверхность лучше часто, но небольшими дозами.
7. Как только побеги из почек отрастут на длину 4–5 см, укоренение можно считать свершенным. Дополнительный признак: если тихонечко потянуть черенок вверх, он окажет сопротивление. Это значит, корешки есть, и они удерживают растение в субстрате.
8. Аккуратно рассаживаем черенки по одному в небольшие контейнеры с питательной почвой. У побегов прищипываем верхушки.
Накрываем банками. Как только обозначится активный рост побегов,
постепенно приучаем саженцы к обычному воздуху – снимаем банки
для проветривания, увеличивая время таких «прогулок на свежем
воздухе» от 10 мин в первый раз и до того момента, когда можно будет убрать колпак совсем. Можно применять следующую формулу:
длительность проветривания увеличивается в день в 1,5 раза: 10 мин,
потом 15 мин, далее 20 мин, потом 30 мин и так далее. Если не соблюдать график «обучения», то привыкшие к высокой влажности побеги завянут и усохнут.
9. Как только корни молодых тутовничков полностью заплетут
почвенный ком, можно пересадить саженцы в сад на постоянное место.
Но предварительно также следует приучить их к открытому грунту.
Сначала ставим на 3 дня в сплошную тень (от стены дома, например),
потом на несколько дней под крону крупного дерева, туда, где в солнечный день свет и тень чередуется в виде движущихся пятен; через
неделю ставим на солнце, но убираем в полуденные часы, а после выдержки на прямом солнышке в течение нескольких дней без признаков
ожогов и увядания, сажаем прямо в сад. Иначе саженцы с подоконника
могут погибнуть от теплового и светового стресса.
52
Получаемые результаты
Студенты подготавливают черенки деревьев, готовят соответствующую питательную среду и автоклавируют ее; производят отделение черенков от листьев; переносят черенки на питательную среду
для культивирования эксплантов в течение 3–4 недель.
Содержание отчета
Студентам необходимо ознакомиться с представленным теоретическим материалом и экспериментальной частью. Произвести все
требуемые исследования, оформить отчет с указанием цели работы,
основных теоретических положений, а также описанием последовательности выполнения работы и полученных результатов.
Контрольные вопросы
1. Что такое эксплант?
2. Для чего используют культуру эксплантов?
3. Какова техника получения экспланта?
4. Какова последовательность операций по подготовке и культивированию
эксплантов шелковицы?
53
ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 10
Мейоз и гаметогенез
Теоретические основы
Высшие растения обычно размножаются половым путем. Половое размножение связано с образованием гаплоидных клеток и с последующим слиянием мужских и женских гамет. Для образования гаплоидных клеток существует механизм, при помощи которого число
хромосом уменьшается вдвое, т.е. клетка из диплоидного состояния
переходит в гаплоидное. Без этого невозможно сохранение у видов
в последующих поколениях свойственного им кариотипа. Такой переход осуществляется во время особого клеточного деления – мейоза.
У растений продуктом мейоза являются гаплоидные микро- и мегаспоры, а гаметы образуются позднее, после двух митотических делений
гаплоидных микроспор или трех митотических делений гаплоидных
мегаспор. Кроме того, у растений мейоз связан с процессом чередования поколений – спорофита и гаметофита – в одном жизненном цикле.
Спорофит и гаметофит – это различные поколения в онтогенезе
растений. Первый из них у цветковых растений длится долго и характеризуется диплоидным состоянием клеток. Мейоз осуществляется на
последнем этапе развития спорофита. Стадия гаметофита непродолжительна по времени. Из микро- и мегаспор образуются мужской и
женский гаметофиты, т.е. поколения клеток с гаплоидным набором
хромосом. При развитии гаметофита образуются гаметы. Слияние
мужской и женской гамет приводит к образованию зиготы, которая
дает начало новому спорофиту.
Фазы мейоза. Первое деление мейоза включает профазу I, метафазу I, анафазу I и телофазу I. Профаза I сложная и длится довольно
долго (от нескольких часов до нескольких дней у полевых культур).
Эта фаза состоит из нескольких стадий: лептотены, зиготены, пахитены (рис. 10.1) (греч. лептос – тонкий; тена – пряжа, двойная нить;
зигон – двойная упряжка; пахитерос – толще), диплотены и диакинеза
(рис. 10.2).
54
В лептотене хорошо видны тонкие, сильно деконденсированные
хромосомные нити. Каждая хромосома имеет свой рисунок –
хромомер. На этой стадии число хромосом диплоидно, дихроматидность не видна в световой микроскоп.
В зиготене происходит взаимное притяжение гомологических
хромосом – конъюгация. Этот процесс начинается с какой-то определенной точки и распространяется по всей длине хромосомы. В течение лептотены–зиготены у растений наблюдается сжатие хромосом
в клубок – синезис, а у животных – образование фигуры «букета».
Во время образования этих фигур хромосомы ориентируются теломерными концами к одному из полюсов.
В пахитене конъюгация хромосом заканчивается. Пары хромосом – биваленты – видны лучше. Удается установить гаплоидное
число бивалентов. В каждый бивалент входит четыре хроматиды, так
как каждая хромосома удвоена.
Рис. 10.1. Стадия пахитены
В диплотене начинают действовать силы, способствующие разъединению конъюгирующих хромосом в биваленте. Разъединение начинается с центромер, но не доходит до конца, так как хроматиды оказываются перекрещенными в результате перехода их от одной хромосомы
к другой. В результате хромосомы образуют петли с хиазмами.
В диакинезе резко укорачиваются хромосомы бивалентов, хиаз-
мы соскальзывают к концам хроматид (процесс терминализации), а
биваленты изменяют свою форму в зависимости от характера кроссинговера (рис. 10.2). Хромосомы бивалента, имеющие на концах
55
центромеры, после одинарного кроссинговера и сползания хиазм к
дистальным концам принимают палочковидную форму. Центромеры
оказываются на противоположных концах, а дистальные концы плотно прилегают друг к другу в центре бивалента.
Рис. 10.2. Первое деление мейоза у кукурузы (Zea mays):
1 – пахитена; 2 – диплотена; 3 – диакинез; 4 – метафаза I;
5 – анафаза I; 6 – телофаза I из Мюнцинга
Метацентрические хромосомы бивалента после двойного кроссинговера принимают кольцевую форму. При этом оба дистальных
конца одной хромосомы оказываются соединенными с двумя дистальными концами другой хромосомы бивалента. Центромеры располагаются в кольце одна против другой. Кроме указанных форм, биваленты могут быть в виде восьмерок. Располагаются они по периферии ядра и удобны для подсчета. Например, у ржи в диакинезе семь
бивалентов, у кукурузы – десять и т.д.
Так заканчивается профаза первого деления мейоза. Вслед за
этим исчезают ядерная оболочка, ядрышко и начинается перемещение бивалентов в экваториальную плоскость клетки. У некоторых
56
животных объектов в профазе I выявляются хромосомы типа ламповых щеток, что связано с активацией транскрипции хромосом.
В метафазе I появляется веретено, и каждый бивалент располагается в экваториальной зоне. Поскольку бивалент имеет две центромеры, то их ориентация отличается от метафазы митоза. Обе центромеры
устанавливаются симметрично по отношению к экваториальной плоскости и направлены к разным полюсам. Центромерами хромосомы
прикрепляются к веретену. В митозе хромосомы имеют по одной центромере, и все они устанавливаются в одной экваториальной плоскости.
На этом заканчивается подготовка хромосом к расхождению.
В анафазе I гомологичные хромосомы расходятся к разным по-
люсам. Каждый бивалент после полного исчезновения хиазм распадается на две дихроматидные хромосомы, одна из которых идет к одному полюсу, другая – к противоположному. От каждой пары гомологов на полюсе оказывается по одной удвоенной хромосоме, а в совокупности – гаплоидное их число, т.е. число хромосом уменьшается
вдвое. В первом делении мейоза центромеры не делятся, как это было
в митозе, поэтому каждая хромосома гаплоидного набора состоит
из двух хроматид.
В телофазе I формируется ядерная оболочка, но дихроматидные
хромосомы не конденсируются. Образуются две клетки, ядра которых содержат вдвое меньше хромосом, чем ядро исходной клетки.
Затем после непродолжительной подготовки к следующему делению,
т.е. интеркинеза, в котором не происходит удвоения хромосом, обе
клетки, обычно синхронно, вступают во второе деление мейоза. Последнее мало отличается от митоза по своему механизму, но имеет
некоторые особенности.
Профаза II может быть очень короткой и редко обнаруживается
на препаратах.
В метафазе II удвоенные хромосомы выстраиваются в экваториальной плоскости веретена деления. Центромеры делятся, как во время митоза. Каждая хроматида становится самостоятельной.
57
В анафазе II к полюсам расходятся хроматиды. У гетерозигот
они не идентичны, как в митозе, потому что участвовали в кроссинговере. Итак, хроматиды, которые наблюдались еще в первом делении мейоза, расходятся к полюсам только во втором делении.
На каждом полюсе клетки оказывается гаплоидное число монохроматидных хромосом.
В телофазе II формируются гаплоидные ядра, происходит цитоки-
нез. После двух делений из одной клетки с диплоидным набором хромосом образуются четыре – с гаплоидным. Изучение мейоза и образования
гамет необходимо при исследовании цитологических основ расщепления гибридов, сцепленного наследования признаков, геномного анализа
и т.д. Мейоз у цветковых растений протекает в пыльниках и семяпочках
во время микро- и мегаспорогенеза. Рассмотрим эти процессы, чтобы
научиться практически распознавать все фазы мейоза [14].
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Цель работы: на давленых препаратах зафиксированных метё-
лок кукурузы определять фазы мейоза.
Материалы, оборудование, реактивы. «Уксусный алкоголь»,
или фиксатор Кларка (3:1), широко применяют в цитологических и
эмбриологических исследованиях, особенно для изготовления давленых препаратов. Материал выдерживают в фиксаторе от 2 до 14 ч, а
иногда и хранят в нём при 0–3 оС.
Состав: абсолютный этиловый спирт или его 96 %-й раствор –
3 ч.; ледяная уксусная кислота – 1 ч.
Приготовление ацетокармина
1 г кармина растворяют в 100 мл 45 %-й уксусной кислоты (45 мл
ледяной уксусной кислоты и 55 мл дистиллированной воды) в течение трех часов. Растворение ведут в колбе на водяной бане с обратным холодильником или на медленном огне (колбонагреватель), стараясь не кипятить, а всякий раз перед закипанием снимать колбу
с раствором с огня (в раствор добавляют нарезанные кусочки стеклянной трубки и ржавый гвоздик). Остывший раствор фильтруют и
помещают в посуду с притертой крышкой.
58
Последовательность выполнения работы
1. Во время цветения зафиксировать бутончики нераскрывшихся
цветков (размер бутонов, пригодных для исследования мейоза, колеблется от 2 до 5 мм).
2. Фиксация должна продолжаться не менее четырех часов.
3. При длительном хранении материала (более двух недель) бу-
тоны переносят в 70 %-й спирт и хранят в холодильнике.
4. Перед окрашиванием пыльники освобождают от чашелистиков
и помещают в тигель с ацетокармином.
5. Тигель с ацетокармином и пыльниками держат в пламени
спиртовки до закипания (не кипятить!).
6. Охладить тигель с ацетокармином и пыльниками до комнатной
температуры.
7. Выбрать 2–3 пыльника из тигелька на часовое стекло в 45 %-ю
уксусную кислоту.
8. В капле 45 % уксусной кислоты на предметном стекле извлечь
пыльники из чашелистиков (если до этого остались таковые).
9. Пыльники закрыть покровным стеклом.
10. Легким нажимом выдавить на покровное стекло содержимое
пыльника.
11. Положив на препарат фильтровальную бумагу, осторожно
удалить избыток уксусной кислоты (вместе с уксусной кислотой
можно удалить и микроспороциты!).
12. Обвести с помощью скальпеля покровное стекло расплавленным парафином.
13. Препарат анализируется сначала под малым увеличением
микроскопа.
Получаемые результаты
Студенты извлекают пыльники на предметное стекло в каплю
ацетокармина. На малом увеличении просматриваются микроспороциты и определяется фаза мейоза. Выбранные для детального ознакомления микроспороциты рассматриваются и фотографируются при
большом увеличении.
59
Содержание отчета
Студентам необходимо ознакомиться с представленным теоретическим материалом и экспериментальной частью. Произвести все
требуемые исследования, оформить отчет с указанием цели работы,
основных теоретических положений, а также описанием последовательности выполнения работы и полученных результатов.
Контрольные вопросы
1. Что такое мейоз и чем отличается от митоза?
2. На какие фазы делится профаза 1 мейоза?
3. Какова техника окраски давленых препаратов?
4. Какую информацию можно получить, оценивая первую профазу мейоза?
5. Какую информацию можно получить, оценивая первую анафазу мейоза?
60
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]