Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Сельскохозяйственная биотехнология. Лабораторный практикум
.pdf
Схема процесса введения в культуру эксплантов корнеплодов моркови представлена на рис. 3.2. Простерилизованные корнеплоды помещают между листами стерильной бумаги. Отрезают верхнюю часть
корнеплода и пробкобурами извлекают цилиндр ткани. У моркови,
в зависимости от задач эксперимента, вычленяют эксплант, содержащий флоэмную и ксилемную паренхиму и камбий или только флоэмную часть (см. рис. 3.2). Цилиндр ткани разрезают на диски и помещают на поверхность агаризованной среды апикальной стороной вниз.
Рис. 3.2. Схема процесса введения в культуру эксплантов
корнеплодов моркови [6]
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Цель работы: освоение техники получения культуры тканей
моркови.
Материалы, оборудование, реактивы: стерильный корнеплод
моркови; стерильный пинцет и скальпель; стерильные бумажные
«матрасики»; газовая горелка или спиртовка; этиловый спирт, 96 %-й
раствор; маточные растворы для приготовления среды Мурасиге –
Скуга; растворы 2,4-Д и 6-БАП (1 мг/л); чашки Петри; колбы Эрленмейера (конические) вместимостью 100 см3; мерный цилиндр; пипетки; стерильная питательная среда для получения и культивирования
каллуса моркови в колбе или пробирке; парафильм (герметизирующая пленка); ножницы; спички; культура каллусной ткани; чашки
Петри со стерильной агаризованной средой, фитогормоны: 2,4дихлорфеноксиуксусная кислота (сокращённо 2,4-Д) – производное
феноксиуксусной кислоты, гербицид из группы синтетических ауксинов. Он был разработан American Chemical Paint Co (гетероауксин);
6-бензиламинопурин 98 %-й представляет собой объёмный порошок
белого цвета волокнистой структуры (корневин).
21
Последовательность выполнения работы
Работа выполняется в четырех вариантах и в несколько этапов.
Различие вариантов обусловлено содержанием фитогормонов в питательных средах, приготовленных на основе среды Мурасиге – Скуга.
Этап 1. Стерилизация корнеплодов. Корнеплоды моркови, исполь-
зуемые для получения изолированных тканей, тщательно очищают,
моют щёткой в тёплом мыльном растворе и затем промывают под струёй проточной воды. Ополаскивают дважды дистиллированной водой,
после чего отмытые корнеплоды переносят в стерильный бокс. Материал погружают в диацид и стерилизуют в течение нескольких секунд.
От стерилизующего раствора корнеплоды отмывают 3–4 раза дистиллированной водой, выдерживают по 15 мин каждый раз.
Этап 2. В каждую из четырех чашек Петри прилить небольшое
количество дистиллированной воды и следующие маточные растворы: 5 мл макросолей; 0,5 мл микросолей; 0,25 мл хелата железа;
1,0 мл витаминов; 5,0 мл мезоинозита. Затем в каждую колбу добавить 3 г сахарозы. После этого в три колбы добавить по одному
из следующих фитогормонов: 2,4-Д (1 мл/л), 6-БАП (1 мл/л), 2,4-Д +
6-БАП. В четвертую колбу фитогормоны не добавляют (контроль).
Полученные растворы перелить в мерные цилиндры и довести объем
дистиллированной водой до 50 мл, рН – до 5,6–5,8, используя
0,1 М КОН. Затем добавить агар-агар (по 0,4 г на каждый вариант
среды) и в колбах автоклавировать среду.
Этап 3. В асептических условиях из корнеплодов пробочным свер-
лом (диаметром 9 мм) извлекают цилиндры длиной 2–3 см и помещают
в стерильные чашки Петри. Ткань разрезают на диски толщиной 1,5–
2,0 мм. Первые и последние диски удаляют, а остальные переносят на
питательные среды. Нагреть стерильную питательную среду на плитке
до расплавления агара. Одновременно подготовить ламинар-бокс к работе (протереть изнутри спиртом). Открыть колбу с питательной средой, обжечь ее горлышко над пламенем спиртовки и в стерильные чашки Петри разлить среду по 15–30 см3. Чашки держать открытыми минимальное время. Дать среде застыть (10–15 мин). Диски-экспланты
разместить на поверхности застывшей питательной среды, чуть вдавли-
22
вая их пинцетом для усиления контакта со средой. При этом для фрагментов корнеплодов моркови следует соблюдать условия физиологической полярности. В одну чашку помещают 10–20 эксплантов. Закрыть
чашку Петри и заклеить парафильмом в два слоя. Парафильм следует
равномерно натягивать для предотвращения разрывов при его усыхании. Поставить чашки Петри в термостат без освещения при температуре 22–25 оС и влажности 70 %. Через три недели рассмотреть и зарисовать образовавшийся каллус.
Этап 4. Перенести, соблюдая строгую стерильность, каллус
в стерильную чашку Петри. Отделить некротизированные участки и
кусочки старой агаризованной среды. Затем каллусную ткань разделить на равные части и асептически перенести в чашки Петри со стерильной питательной средой. Чашки Петри поместить в термостат
с температурой 25 оС и влажностью 60 % на 3–4 недели. В конце этого срока пронаблюдать и зарисовать каллусную ткань.
Получаемые результаты
Студенты готовят питательную среду и автоклавируют ее; производят культивирование изолированных тканей и получают каллусную
культуру; производят пассирование каллусной культуры (перенос
на свежую питательную среду).
Содержание отчета
Студентам необходимо ознакомиться с представленным теоретическим материалом и экспериментальной частью. Провести все требуемые исследования, оформить отчет с указанием цели работы, основных теоретических положений, а также описанием последовательности выполнения работы и полученных результатов.
Контрольные вопросы
1. Что такое каллус?
2. Чем регулируется образование и рост каллуса?
3. В чем секрет успешного получения эксплантов?
4. Из каких фаз состоит кривая роста каллусной ткани?
5. В чем состоит опасность многочисленных пассирований каллусной ткани?
23
ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 4
Выделение и культивирование
апикальных меристем картофеля
Теоретические основы
Культура изолированных апикальных меристем используется для
получения свободного от вирусов посадочного материала. Метод основан на том, что апикальная меристема, представляющая собой конус активно делящихся клеток высотой 0,1 мм (100 мкм) и шириной
0,25 мм, обычно свободна от вирусов. Поскольку меристему бывает
трудно вычленить без повреждения, часто ее отделяют с 1–2 листовыми примордиями (апексы размером 100–250 мкм). Для повышения
эффективности оздоровления картофеля применяют сочетание метода верхушечной меристемы с термо- и химиотерапией. Тепловая обработка вызывает инактивацию вирусов, химические вещества ингибируют их развитие. Выращенные из апикальных меристем безвирусные растения могут быть размножены и высажены в теплицы
для получения безвирусных клубней. Для ускоренного размножения
оздоровленного материала используются также микроклубни, образовавшиеся на безвирусных растениях in vitro [8, 10].
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Цель работы: освоение методов выделения и культивирования
апикальных меристем.
Материалы, оборудование, реактивы: проросшие клубни кар-
тофеля; бинокулярная лупа; скальпели; препаровальные иглы; флаконы с 96 %-м спиртом для стерилизации инструментов; 5 %-й раствор
гипохлорита кальция или натрия; пинцеты; спиртовка, вата, стерильные чашки Петри.
Последовательность выполнения работы
Клубни картофеля хранят при температуре 4–6 оС, затем проращивают в темноте в течение 30–45 дней при 20–22 оС. Работы по вы-
24
членению проводят в простерилизованном с помощью бактерицидных ламп в ламинар-боксе. Рабочее место (стол, бинокулярная лупа)
и штативы с пробирками протирают спиртом. Инструменты (пинцеты, скальпели, иглы) стерилизуют перед каждым вычленением, погружая в спирт, с последующим обжиганием (рис. 4.1).
Рис. 4.1. Меристематические ткани:
1 – в зародыше семени, 2 – в проростке растения, 3 – в кончике корня;
а – верхушечная меристема побега, б – верхушечная меристема корня, в – прокамбий,
г – интеркалярная меристема листа, д – интеркалярная меристема побега, е – камбий,
ж – верхушечная меристема придаточного корня, з – верхушечная меристема
бокового корня, и – верхушечная меристема пазушной почки,
к – ксилема, л – перицикл, м – флоэма [10]
Ростки картофеля опустить в химический стакан и залить на 3–
5 мин 5 %-м раствором гипохлорита кальция или натрия. Затем не ме-
нее 3 раз промыть их стерильной водой, поместить в стерильную чашку
Петри и добавить несколько капель автоклавированной воды. Перед
вычленением с помощью препаровальной иглы под бинокулярным
25
микроскопом с верхушки ростка удалить покровные листочки, последовательно обнажая меристему с примордиальными листочками. Как
верхушечную, так и боковые меристемы размером 100–250 мкм отделить тонкой иглой, зажатой в цанговый держатель. Каждую операцию
проводят отдельным простерилизованным инструментом. Меристему
на острие иглы перенести на поверхность питательной среды в пробирку и закрыть пробкой над пламенем горелки. Штатив с пробирками поместить в культуральную комнату.
В качестве питательной среды используют модифицированную
среду МС, заранее приготовленную и простерилизованную в автоклаве при давлении 1 атм в течение 20 мин. (табл. 4.1).
Таблица 4.1
Модифицированная питательная среда Мурасиге – Скуга (МС)
для культивирования апикальных меристем картофеля
Компоненты питательной среды, мг/л
Минеральные
компоненты
Сахароза 20000 Никотиновая кислота 2
Глюкоза 20000 Фолиевая кислота 0,5
Гидролизат казеина 10000 Кинетин 0,5
Мезо-инозит 100 Пантотенат Са 10
Тиамин 1 Рибофлавин 0,5
Пиридоксин 1 Биотин 1
Аденин 40 Активированный уголь 10000
Витамин В12 0,015 Агар-агар 7000
* по прописи Мурасиге – Скуга.
МС* ГК Масса
навески
РН 5,7–5,8
Получаемые результаты
Студенты проращивают клубни картофеля; готовят модифицированную питательную среду Мурасиге – Скуга и автоклавируют ее;
производят отделение верхушечной и боковой меристем точек роста
картофеля; переносят их на питательную среду, где происходит культивирование меристем в течение 2, 3, 4 недель.
26
Содержание отчета
Студентам необходимо ознакомиться с представленным теоретическим материалом и экспериментальной частью. Произвести все
требуемые исследования, оформить отчет с указанием цели работы,
основных теоретических положений, а также описанием последовательности выполнения работы и полученных результатов.
Контрольные вопросы
1. Для чего используют культуру изолированных апикальных меристем?
2. Что такое апикальная меристема?
3. Какова техника извлечения апикальных меристем?
4. Для чего используют термо- и химиотерапию?
5. Какова последовательность операций по подготовке и культивированию
апикальных меристем?
27
ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 5
Получение культуры изолированных зародышей пшеницы
Теоретические основы
Эмбриокультура представляет собой культуру изолированных
зиготических зародышей и имеет ряд достоинств:
1) получение клонов растений-перекрестноопылителей с эффек-
том самонесовместимости.
Несовместимость у растений проявляется в неспособности пыльцы прорастать на рыльцах растений с определенными генотипами.
Она не связана с нарушением процессов споро-, гаметогенеза и эмбриогенеза.
Рис. 5.1. Гаметофитная несовместимость [11]
Реакция несовместимости проявляется в пестике, диплоидная
ткань которого контролируется генотипом материнского растения
(спорофита). Известно два типа генетических систем самонесовместимости – гаметофитная и спорофитная. Гаметофитная определя-
ется генотипом пыльцевого зерна. У большинства растений она кон-
28
тролируется одним геном S, представленным в популяциях серий
1S3
1
множественных аллелей, число которых достигает у ряда видов нескольких сотен (Leguminoseae, Solanaceae, Rosaceae, Liliaceae и др.).
Клетки диплоидного пестика всегда имеют два аллеля, в каждом
пыльцевом зерне представлен лишь один из этих аллелей. Если в ге-
нотипе пестика есть тот же аллель, что и в генотипе пыльцевого
зерна, то развитие пыльцевой трубки подавляется (рис. 5.1). В попу-
ляции встречается полная несовместимость при самоопылении; совместимость половины пыльцевых зерен и полная совместимость, при которой все пыльцевые зерна одного растения способны опылить другое
растение (табл. 5.1). Очевидно, что все потомки в скрещиваниях оказываются гетерозиготными по генам самонесовместимости [11];
Таблица 5.1
Уровни перекрестной совместимости в популяции
при гаметофитной системе самонесовместимости /10/
Тип
скрещивания
Генотип Пыльцевые зерна Генотип
♀ ♂ Функцио-
нальные
Нефункцио-
нальные
потомства
Оба растения
с одним и тем же
генотипом
(самоопыление) S1S2 S1S2 нет все нет
Растения различаются
по одному аллелю:
прорастает половина
S1S2
S1S3
S1S3
S1S2
S3
S2
S1
S1
пыльцы
Растения различаются
S1S2
S3 S1
S3; S1
нет
по обоим аллелям:
S3 S1
S1S2
S1; S2
нет
прорастает вся пыльца
2) преодоление постгамной (после оплодотворения) несовмести-
S1S3; S2S3
S1S2; S2S3
S
; S1S
S2S3; S2S1
S1S3; S2S
S1S1; S2S1
3
мости, проявляющейся как несовместимость зародыша и эндосперма
при отдаленной гибридизации.
29
Прогамная несовместимость – физиологическая несовместимость
партнеров при отдаленном скрещивании, проявляющаяся на этапе
до оплодотворения. Она может быть обусловлена физиологическими
(несоответствие во времени созревания пыльцы отцовского растения
или отсутствие секрета рыльца пестика материнского растения), а
также морфологическими причинами (различие партнеров по длине
столбика пестика и пыльцевой трубки; блокирование роста трубки на
разных этапах ее пути от рыльца пестика до микропиле семяпочки
вследствие тканевой несовместимости партнеров). Основной способ
преодоления прогамной несовместимости – оплодотворение in vitro.
Метод заключается в совместном культивировании пыльцы и неоплодотворенных семяпочек, которое может осуществляться двумя
различными способами. В первом случае столбик пестика срезается,
завязь помещается на питательную среду, и на нее наносят готовую
пыльцу. Второй вариант данного метода предполагает вскрывание завязи и перенос на питательную среду кусочков плаценты с семяпочками, вблизи которых или непосредственно на их поверхности культивируется готовая пыльца. Визуально определить прошло ли оплодотворение in vitro можно по быстрому увеличению размеров семяпочек. Сформировавшийся зародыш, как правило, не переходит в состояние покоя, а сразу прорастает и дает начало гибридному поколению. Опыление in vitro хорошо удается для растений семейства маковых, гвоздичных, пасленовых (табак, петуния), у которых в завязях
имеются многочисленные семяпочки [11].
Постгамная несовместимость – несовместимость таксономиически отдаленных партнеров, которая наблюдается после оплодотворения, и приводит к образованию щуплых невсхожих семян.
Физиологические причины постгамной несовместимости заключаются в несоответствии темпов развития зародыша и эндосперма
либо непригодности (токсичности) метаболитов тканей материнского
растения для питания зародыша. Способ их преодоления – культивирование незрелых гибридных зародышей на питательной среде.
Постгамная несовместимость может быть обусловлена и генетическими причинами, которые выражаются в аномалиях развития ор-
30
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]