Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Молекулярная биотехнология. Учебно-методическое пособие
.pdf
Каждая тест – система иммуноферментного анализа
биологических объектов имеет свои особенности при учете
результатов, что оговаривается в инструкциях по применению. Тривиальность толкования (интерпретации) результатов
полученных методом ИФА, не всегда возможна. Только понимание того, что именно на самом деле определяет тест, позволяет правильно трактовать результат.
Далеко не всегда результат лабораторного теста по определению поверхностного антигена инфекционного агента
полностью соответствует содержанию биологически активного инфекционного материала. Результат теста зависит от многих составляющих инфекционного процесса и от конкретной
реализации тест-систем. Имеют значение технология получения диагностических антигенов и некоторые другие факторы.
Еще более неоднозначной может быть трактовка результатов
теста на наличие антител к антигенам. Во-первых, динамика
образования антител может запаздывать динамики изменений
уровня антигена инфекционного агента. Во-вторых, уровень
специфических иммуноглобулинов (Ig), который собственно
и определяется в тест-системах ИФА, может сохраняться высоким и после подавления инфекции. Кроме того, при анализе результатов такого теста необходимо помнить о том, какого класса Ig определялись в применявшемся тесте, поскольку
при развитии иммунного ответа происходит закономерная
смена классов Ig.
Опыт 1. ИФА проб сывороток крови животных
на выявление микобактериальных антител
Реактивы, оборудования
Иммунологические планшеты, дозаторы автоматические
с переменным объемом, спектрофотометр, микобактериальные антигены, исследуемые пробы сывороток крови, иммун-
81
ные сыворотки позитивные, иммунные сыворотки негативные; антивидовые антитела, меченые пероксидазой; субстрат
(орто-фенилендиамин); буферные растворы для разведения
антигенов, антител, субстрата; стоп - реагент.
Ход работы.
В лунки планшета вносят по 0,1 мл раствора антигена в
карбонатном буфере с рН 9,7 и инкубируют 2 часа при 370С.
По истечении этого времени лунки планшета промывают 1-2
раза 0,05 % раствором твина-20 в физиологическом растворе
(раствор для промывки) и вносят по 0,1 мл 2% раствора альбумина для заполнения свободных мест в лунках. Инкубируют и промывают лунки планшета в тех же условиях. Сенсибилизированные таким образом иммунологические планшеты
можно хранить при + 2-40С в течении 6 месяцев.
В А ряд сенсибилизированного планшета вносят по 0,1
мл исследуемых сывороток разведенных 1:5. В две последние
лунки ряда вносят негативную и позитивную сыворотки в таких же разведениях (отрицательный и положительный контроли). Проводят титрование сывороток по вертикали 1:2.
После инкубации 30 мин при 37 оС и промывки 3-5 раз в лунки планшета вносят по 0,1 мл раствора антивидовых антител
связанных с пероксидазой (конъюгат) для выявления образовавшихся комплексов антиген-антитело. Повторяют инкубацию и промывку в прежних условиях и вносят в каждую лунку раствора субстрата для фермента. В дальнейшем планшет
вновь инкубируют 15 минут при 37 оС и реакцию останавливают внесением в лунки стоп - реагента (2 н. раствор серной
кислоты).
Результаты реакции учитывают визуально или на фотометрическом счетчике. В первом варианте результат определяют по разнице окраски в лунках с испытуемой сывороткой
и нормальной одного и того же разведения (но не меньше
82
1:200). Если эта разница очевидна, следовательно, донор этой
сыворотки – носитель возбудителя туберкулеза. Во втором
случае на счетчике определяют показатели оптической плотности (ОП) растворов в лунках. Если отношение ОП лунок с
испытуемой сывороткой, в разведении 1:200, к таковым лунок с отрицательным контролем равно или более 2, то значит,
испытуемая сыворотка содержит антитела к возбудителю заболевания.
6. Раздел 4
Техническая микробиология.
Микроорганизмы – наиболее древняя форма организации жизни на Земле. По количеству они представляют собой
самую значительную и самую разнообразную часть организмов, населяющих биосферу.
К микроорганизмам относят:
1) бактерии;
2) вирусы;
3) грибы;
4) простейшие;
5) микроводоросли.
Техническая микробиология или микробная биотехноло-
гия - раздел биотехнологии, разрабатывающий способы куль-
тивации полезных микроорганизмов в промышленных масштабах.
Техническая микробиология изучает микроорганизмы,
используемые в производственных процессах с целью получения различных практически важных веществ: пищевых
продуктов, лекарственных препаратов, БАВ и др.
Условно микробные производства можно разделить на
три типа:
1. Основанные на использовании живой или инактиви-
83
рованной биомассы микроорганизмов. Сюда относится производство пекарских, винных и кормовых дрожжей, вакцин,
белково-витаминных концентратов (БВК), средств защиты
растений, заквасок для получения кисломолочных продуктов
и силосования кормов, почвоудобрительных препаратов и др.
2. Производящие продукты микробного биосинтеза, к
числу которых относятся антибиотики, гормоны, ферменты,
аминокислоты, витамины.
3. Основанные на получении продуктов брожения, гниения, например утилизация целлюлозы и различных отходов с
целью получения углеводов, биогаза, биоэтанола. Сюда же
относятся получение спиртов, органических кислот, растворителей, а также биотехнология утилизации неприродных соединений.
В целом такая классификация микробного производства
и определяет основные направления развития технической
микробиологии. В зависимости цели, задач и характера решаемых проблем различают, как отдельные направления пищевую, медицинскую, социальную, экологическую, сельскохозяйственную и др. науки определяющие основу технической микробиологии.
Занятие 1.
Культивирование микроорганизмов.
Питательные среды.
Культивирование микроорганизмов является одним из
основных методов микробиологии. От умения культивировать микроорганизмы в лабораторных условиях в значительной степени зависят успехи их изучения и практического
применения. Для культивирования микроорганизмов (выращивание в искусственных условиях in vitro) необходимы особые субстраты – питательные среды. На средах микроорганизмы осуществляют все жизненные процессы (питаются,
84
дышат, размножаются и т. д.), поэтому их еще называют
«средами для культивирования». Питательные среды являются основой микробиологической работы, и их качество нередко определяет результаты всего исследования. Среды
должны создавать оптимальные (наилучшие) условия для
жизнедеятельности микроорганизмов.
Потребности микроорганизмов в питательных веществах
чрезвычайно разнообразны и определяются особенностями
их метаболизма. В широком смысле слова питательная среда
должна соответствовать следующим требованиям:
Во-первых, питательная среда должна включать доступный для клетки источник энергии. Для одних организмов
(фототрофов) таким источником служит свет, для других –
органический (хемоорганотрофы) или неорганический (хемолитотрофы) субстрат.
Во-вторых, среда должна содержать все необходимые
компоненты для биосинтетических процессов в клетке. Причем синтетические способности микроорганизмов могут
варьировать от использования углекислого газа в качестве
единственного источника углерода (аутотрофы) до потребности в более восстановленных соединениях углерода – кислотах, спиртах, углеводах и др. (гетеротрофы). В узком смысле
слова любая искусственная питательная среда должна соответствовать следующим требованиям: содержать все необходимые для роста питательные вещества в легко усвояемой
форме; иметь оптимальную влажность, вязкость, рН, быть
изотоничной, сбалансированной с высокой буферной емкостью и, по возможности, прозрачной.
Классификация питательных сред
Потребность в питательных веществах и свойствах среды у разных видов микроорганизмов неодинакова. Это исключает возможность создания универсальной среды. Кроме
85
того, на выбор той или иной среды влияют цели исследования
(выделение, выращивание, длительное сохранение микроорганизмов в культурах). В настоящее время предложено огромное количество сред, в основу классификации которых
положены следующие признаки:
1. Исходные компонент. По исходным компонентам раз-
личают натуральные, полусинтетические, синтетические
среды. Натуральные среды готовят из продуктов животного и
растительного происхождения (мяса, рыбы, молока, овощей,
фруктов и др.), поэтому точный состав этих сред неизвестен.
Чаще всего обычно используют полусинтетические среды, в
которых ценные пищевые продукты (мясо и др.) заменены
непищевыми: костной и рыбной мукой, кормовыми дрожжами, сгустками крови и др. Примером таких сред могут быть
мясопептонные среды, в которые, кроме мясного экстракта и
пептона, входят: поваренная соль, фосфат 6 калия. Полусинтетические среды хороши для выращивания определенных
групп микроорганизмов, а также для выделения из среды
продуктов их жизнедеятельности: антибиотиков, витаминов.
Синтетические среды готовят из определенных химически
чистых органических и неорганических соединений, взятых в
точно указанных концентрациях и растворенных в бидистиллированной воде. Важное преимущество этих сред в том, что
состав их постоянен (известно, сколько и какие вещества в
них входят), поэтому эти среды легко воспроизводимы.
2. Консистенция (степень плотности) Среды бывают
жидкие, плотные и полужидкие. Плотные и полужидкие сре-
ды готовят из жидких веществ, к которым для получения среды нужной консистенции прибавляют обычно агар-агар или
желатин. Плотность этих сред при рН ниже 6,0 и выше 7,0
уменьшается, и они плохо застывают. Кроме того, в качестве
плотных сред применяют свернутую сыворотку крови, свер-
86
нутые яйца, картофель.
3. Состав. Среды делят на простые и сложные. К пер-
вым относят мясопептонный бульон (МПБ), мясопептонный
агар (МПА), бульон и агар Хоттингера, питательный желатин
и пептонную воду. Сложные среды готовят, прибавляя к простым средам кровь, сыворотку, углеводы и другие вещества,
необходимые для размножения того или иного микроорганизма.
4. Назначение а) основные (общеупотребительные) сре-
ды служат для культивирования большинства патогенных
микробов. Например, МПА, МПБ, бульон и агар Хоттингера,
пептонная вода; б) специальные среды служат для выделения
и выращивания микроорганизмов, не растущих на простых
средах. в) элективные (избирательные) среды служат для выделения определенного вида микробов, росту которых они
благоприятствуют, задерживая или подавляя рост сопутствующих микроорганизмов. Среды становятся элективными
при добавлении к ним определенных антибиотиков, солей,
изменении рН. г) дифференциально-диагностические среды
позволяют отличить (дифференцировать) один вид микробов
от другого по ферментативной активности, например среды
Гисса с углеводами и индикатором. При росте микроорганизмов, расщепляющих углеводы, изменяется цвет среды. д)
консервирующие среды предназначены для первичного посева
и транспортировки исследуемого материала; в них предотвращается отмирание микроорганизмов и подавляется развитие других микроорганизмов.
Опыт 1. Ферментативный гидролиз казеина молока
и определение аминного азота в гидролизате
К обезжиренному молоку добавляют панкреатин из расчета 1мл фермента на 1 литр молока. Закрывают пробкой и
87
ставят в термостат на 24 часа при 400С. В первые часы инкубации содержимое колб необходимо периодически перемешивать. По истечении этого времени вносят хлороформ в
объеме 5 мл на 1 литр молока.
Определение аминного азота методом формольного
титрования. Метод основан на способности формальдегида
связывать свободные аминогруппы с образованием метиленовых производных аминокислот (основание Шиффа). По
количеству карбоксильных групп, нейтрализованных щелочью в процессе титрования вычисляют количество свободных
аминогрупп (аминокислот) образовавшихся в процессе гидролиза белка.
Реактивы и оборудования.
0,1 н раствор NaOH, формоловая смесь (50 мл формалина и 1 мл 0,5% раствора фенолфталеина). Конические колбы
для титрования, бюретки, пипетки.
Ход работы.
В коническую колбу на 50 мл берут 2,5 мл обезжиренного молока и добавляют 1,25 мл формоловой смеси, перемешивают и титруют 0,1 н раствором NaOH до слабо розового
окрашивания (контрольная проба).
В другую коническую колбу в тех же обьемах берут
гидролизата, формоловой смеси и титруют в выше указанных
условиях (опытная проба).
Количество аминного азота в гидролизате рассчитывают
по формуле:
88
N = (V – V1) х 0,14 х 100
где: N –аминный азот, V – количество щелочи пошедшее
на титрование в опытной пробе, V1 - количество щелочи пошедшее на титрование в контрольной пробе, 0,14 - коэффициент соответствия 1мл 0.1 н раствора щелочи, 100 - коэффициент перевода в мг%.
Занятие 2.
Культивирование микроорганизмов.
Фазы роста микроорганизмов
Способы культивирования микроорганизмов
Способ культивирования зависит от конечной цели
культивирования (целью является либо накопление биомассы, либо получения определенного продукта жизнедеятельности - метаболита).
Поверхностное культивирование заключается в выра-
щивании аэробных микроорганизмов на поверхности жидких
и сыпучих питательных сред. При этом микроорганизмы получают кислород непосредственно из воздуха. Осуществляется поверхностное культивирование в специальных ваннах -
кюветах.
Глубинное культивирование проводится на жидких пи-
тательных средах, в которых микроорганизмы развиваются во
всем объеме питательной среды. Сочетание питательной среды и растущих в ней микроорганизмов называют культураль-
ной жидкостью. Осуществляется глубинное культивирование в специальных аппаратах – ферментатора.
При периодическом культивировании весь объем питательной среды засевают чистой культурой, которую выращивают в оптимальных условиях определенный период времени
до накопления нужного количества целевого продукта. Сле-
89
дует отметить, что так как культивирование ведется на не возобновляемой питательной среде (в стационарных условиях),
то клетки все время находятся в меняющихся условиях. Таким образом, периодическую систему можно рассматривать
как замкнутую систему.
При непрерывном культивировании культура находится
в специальном аппарате, куда постоянно притекает питательная среда и с такой же скоростью отводится культуральная
жидкость. Для микроорганизма создаются неизменные условия среды, поэтому непрерывную систему можно рассматривать как открытую систему.
Поверхностное культивирование может быть только периодическим, в то время как глубинное культивирование может осуществляться и периодическим, и непрерывным способом.
Сущность периодического способа заключается в том,
что весь объем питательной среды загружают в аппарат сразу, добавляют культуру микроорганизмов и при оптимальных
условиях ведут процесс до тех пор, пока не накопится нужное
количество биомассы или продуктов жизнедеятельности
микроорганизмов - метаболитов. При периодическом культивировании изменяется состав среды (уменьшается концентрация питательных веществ и увеличивается количество метаболитов); скорость роста; морфологические и физиологические свойства культуры. К тому же возникают технологические что затрудняет контроль и автоматизацию процесса.
Эти недостатки устраняются применением непрерывных
способов культивирования. Данные методы характеризуются
непрерывным поступлением в ферментатор свежей питательной среды и непрерывным оттоком готовой культуральной
жидкости вместе с клетками введенной культуры микроорганизма. Различают гомогенно- и гетерогенно-непрерывное
90
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]