Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Молекулярная биотехнология. Учебно-методическое пособие
.pdf
культивирование. Гомогенно-непрерывный способ непрерывного культивирования, при котором во всех точках ферментатора, благодаря интенсивному перемешиванию, сохраняются одинаковые параметры среды и содержание микробной биомассы в единице объема остается все время постоянным. Гетерогенно-непрерывный способ характеризуется незначительным перемешиванием среды или полным его отсутствием. При этом состав среды в любой точке аппарата различен, однако показатели системы в целом не изменяются во
времени. Непрерывное культивирование обеспечивает непрерывность и стандартность получаемого продукта. Процесс
все время протекает с одинаковой скоростью, это позволяет
его автоматизировать.
Фазы роста бактерий
При внесении микроорганизмов в питательную среду
они обычно растут до тех пор, пока содержание питательных
веществ не достигнет минимума, после чего рост прекращается. Процесс роста и размножения микроорганизмов в такой
системе описывается кривой роста, которая имеет Sобразную форму.
Рис.11. Фазы роста бактерий.
91
1 – лаг фаза. Фаза адаптации, приспособления. Внесенные в питательную среду клетки микроорганизмов сразу не
начинают размножаться. В этот период клетки приспосабливаются к условиям и составу среды и окружающим условиям.
Продолжительность этой фазы (может длиться от нескольких
часов до нескольких суток) зависит от состава питательной
среды, рН, температуры, возраста и количества внесенных
клеток. В этот период увеличивается количество нуклеиновых кислот, особенно рибонуклеиновой кислоты (РНК), что
необходимо для синтеза белков.
2 – логарифмическая или фаза ускоренного роста Это
стадия интенсивного размножения. Клетки снабжены питательными веществами, не накопили вредных продуктов обмена, поэтому увеличение массы и объема клеток максимальное. В этой фазе большинство клеток является биологически
активными и молодыми. Если культуру в данной фазе развития перенести в другую емкость с аналогичным субстратом,
то скорость роста микроорганизмов не изменится. В этом
случае лаг-фаза будет отсутствовать. Если же пересев происходит во время другой стадии, то фаза адаптации обязательно
будет присутствовать. Клетки по размеру мелкие, так как
почкование опережает рост, но большая поверхность таких
клеток обеспечивает высокую скорость биохимических процессов. На этой стадии культура более чувствительна к действию неблагоприятных факторов.
3 фаза - замедленного роста Постепенно происходит накопление продуктов обмена веществ клеток, которые в определенных концентрациях могут мешать нормальному протеканию обменных процессов, поэтому скорость размножения
постепенно замедляется. Скорость роста также уменьшается
за счет сокращения площади поверхности клеток из-за тесного окружения одних клеток другими, а именно через их по-
92
верхность происходят процессы обмена веществ: попадание
питательных веществ в клетку и выведение метаболитов.
4 фаза – стационарная. Период, в течение которого количество живых клеток остается постоянным. В этот период
число отмирающих клеток равно числу вновь образующихся.
Скорость размножения равна скорости отмирания. Общая
биомасса (сумма живых и отмирающих клеток) увеличивается. В этот период в среде накапливаются продукты обмена
веществ, которые имеют важное практическое значение
(ферменты, антибиотики и др.).
5 фаза – отмирания. Период, когда в результате истощения питательной среды и максимального накопления продуктов обмена скорость отмирания клеток намного превышает
скорость их размножения. Происходит автолиз - распад белков мертвых клеток под действием собственных ферментов.
В результате этого уменьшается общая численность клеток и
концентрация биомассы. Эта фаза является противоположностью логарифмической. Если в логарифмической фазе роста
достигается максимальная скорость размножения, то в фазе
отмирания – максимальная скорость отмирания.
Опыт 1. Определение фазы роста молочнокислых
бактерий в гидролизате казеина.
Для успешного культивирования того или иного микроорганизма питательные среды по своим свойствам должны
быть приближены к естественным условиям его обитания.
Для культивирования бактерий рода Lactobacillus используются среды, богатые питательными веществами (дрожжевой
экстракт, гидролизат обезжиренного молока, пептон, твин-
80), различными солями, в том числе ацетатом натрия и др., и
имеющие низкий уровень рН (4,5-6,2).
Реактивы и оборудования.
93
Жидкаю питательная среда МРС-2, лиофильно высушенные штаммы Lactobacillus, термостат, конические колбы
на 50 мл, пипетки, спектрофотометр.
Ход работы.
Лиофильно высушенные штаммы разводили в 1 мл стерильного физиологического раствора и 0,1 мл высевали на
жидкую среду МРС-2 в объеме 10 мл в конической колбе на
50 мл. Инкубацию проводили в течение сутки при 37 0С. Через каждые 4 часа отбирали по 0,5 мл раствора в другие пробирки и все 6 проб помещали в холодильник. Затем все пробы
разводили в 10 раз физраствором и определяли ОП (оптическая плотность) спектрофотометрически. Показания спектрофотометра прямопропорциональна количеству бактериальных клеток в пробах (степень помутнения). Исходя из этой
косвенной зависимости составляли график роста молочнокислых бактерий.
94
КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ
1. Биотехнология – история становления как наука.
2. Молекулярная биотехнология – основные направле-
ния и их характеристика.
3. ДНК – как носитель генетической информации.
4. Секвенирование ДНК. Секвенаторы.
5. Ферменты генной инженерии. Рестриктазы.
6. Методы изучения генетического материала.
7. ПЦР. Основные принципы. Методика постановки.
8. Нокаутирование генов – как один из основных мето-
дов изучения генома.
9. Современные методы генодиагностики и генотерапии.
10. Молекулярные механизмы репарации ДНК.
11. Основные этапы получения рекомбинантных моле-
кул ДНК.
12. Способы получения генов.
13. Генетический вектор. Виды и требования к генетиче-
ским векторам.
14. Методы внедрения вектора в клетку.
15. Генетическая инженерия растений. Основные этапы
и еѐ задачи.
16. Трансформация растений с помощью агробактерий.
17. Генетически модифицированные организмы. Спосо-
бы их получения.
18. Методы идентификации ГМ-продуктов.
19. Трансгенез. Способы получения трансгенных живот-
ных. Основные этапы.
20. Технология трансгенеза методом микроинъекций в
пронуклеус.
21. Ретровирусные векторы в трансгенезе и их значение.
22. Антисмысловая РНК. Введение генов кодирующих
антисмысловую РНК как новый подход в генной инженерии.
95
23. Способы и методы клонирования. Виды клонирова-
ния.
24. Стволовые клетки. Перепрограммирование сомати-
ческих клеток.
25. Получение гибридом – как достижение клеточной
инженерии.
26. Моноклональные антитела и их значение в иммуно-
логии, клинической лабораторной практике и в других областях медицины.
27. Современная техническая микробиология и еѐ вклад
в охрану здоровья и обеспечение человека продовольствием,
охрану природы, энергообеспечение.
28. Производство пробиотиков – как один из разделов
технической микробиологии.
29. Пребиотики. Сравнительная характеристика пре- и
пробиотиков.
30. Биотехнология кормовых препаратов. Получение
кормовых белков, незаменимых аминокислот, витаминных
препаратов и др.
31. Ферменты. Классификация и свойства.
32. Источники ферментов для инженерной энзимологии.
33. Иммобилизованные ферменты. Особенности иммо-
билизованных ферментов.
34. Основные направления применения иммобилизован-
ных ферментов. Способы иммобилизации.
35. Биореакторы, принцип действия. Понятие о биосен-
сорах.
36. Методы ИФА. Принцип метода. Области примене-
ния.
37. Ферментные препараты и области их применения.
Ферментные препараты в животноводстве.
96
РЕКОМЕНДУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА
1. Якупов Т.Р., Фаизов Т.Х. Молекулярная биотехноло-
гия. Санкт – Петербург. 2019.-
2. Абрамова З.И. Введение в генетическую инженерию.
Учебное пособие для самостоятельной работы студентов. Казань. КФУ. -2008. – 168с.
3. Вечканов Е. М., Сорокина И. А. Основы клеточной
инженерии: Учебное пособие. Ростов-на-Дону. 2012. – 136с.
4. Глик Б., Дж.Пастернак. Молекулярная биотехнология.
Принципы и применение. Москва «Мир». 2002.-589С.
5. Тихонов И.В. Биотехнология. Санкт – Петербург.
2005.-792С.
6. Шевелуха В.С. Сельскохозяйственная биотехнология.
Москва, 2003.-469С.
7. Щелкунов С.Н. Генетическая инженерия. Новоси-
бирск. – 2004.
97
СЛОВАРЬ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ ТЕРМИНОВ
АМПЛИФИКАЦИЯ(Amplification) – образование дополнительных копий хромосомных последовательностей
ДНК.
АНТИГЕНЫ (Antigens) – белки, индуцирующие образование в иммунной системе антитела, способного к специфическому взаимодействию с веществом, вызывающим образование антитела.
АНТИСЫВОРОТКА (Antiserum) – сыворотка иммунизированного животного (человека), содержащая антитела
против чужеродных агентов.
АНТИТЕЛА (Antibodies) – белки, вырабатываемые иммунной системой, блокирующие действие чужеродных патогенных агентов.
БЕЛКОВО-ВИТАМИННЫЙ КОНЦЕНТРАТ (БВК) –
белковый концентрат из кормовых дрожжей.
БЕССМЫСЛЕННЫЙ КОДОН – один из трех триплетов,
UAG, UAA, UGA, вызывающих терминацию синтеза белка
(UAG известен как amber-кодон, UAA – как ochre-кодон,
UGA – как opal-кодон).
БИБЛИОТЕКА ГЕНОМА (Genome library) – набор кло-
нированных фрагментов ДНК, содержащий весь геном.
БИОКОНВЕРСИЯ (Bioconvertion) – получение биогаза
(метана) из органических отходов – навоза и других методом
их сбраживания.
БИОМАССА (Biomass) – общая масса особей одного вида, группы видов или сообщества в целом на единицу поверхности или объема местообитания.
БЛОТТИНГ ДНК ПО САУЗЕРНУ (Southern blotting) –
процедура переноса денатурированной ДНК из агарозного
геля на нитроцеллюлозный фильтр для гибридизации с ком-
98
плементарными нуклеотидными последовательностями.
БЛОТТИНГ РНК (Blotting RNA, northern blotting ) – перенос РНК из агарозного геля на интроцеллюлозный фильтр
для последующей гибридизации с комплементарной ДНК.
ВЕКТОР (Vector) – саморегулирующаяся (автономная)
молекула ДНК, используемая в генной инженерии для переноса генов от организма-донора в организм-реципиент, а
также для клонирования нуклеотидных последовательностей.
ВЕРТИКАЛЬНЫЙ ПЕРЕНОС ГЕНОВ (Vertical genes
transfer) – перенос генетической информации от клетки или
организма к потомству при помощи обычных генетических
механизмов.
ГЕН (Gene) – элементарная единица наследственного
вещества и информации; локализованный участок хромосомы
(локус), кодирующей структуру одной или нескольких полипептидных цепей, или молекулу РНК, или определенную регуляторную функцию.
ГЕНЕТИЧЕСКИЙ КОД (ГК) (Genetic code, GC) – система записи наследственной информации в виде последовательности нуклеотидов в молекулах нуклеиновых кислот.
Единицей ГК служит кодон, или триплет (тринуклеотид). ГК
определяет порядок включения аминокислот в синтезирующуюся полипептидную цепь.
ГЕННАЯ или ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ИНЖЕНЕРИЯ – (Gene
engineering) – совокупность приемов, методов и технологий, в
том числе технологий получения рекомбинантных рибонуклеиновых и дезоксирибонуклеиновых кислот, по выделению
единичных или нескольких генов из организма, осуществлению манипуляций с генами и введению их в другие организмы.
ГЕНОМ (Genome) – совокупность генов, содержащихся
в гаплоидном (одинарном) наборе хромосом данного орга-
99
низма; гаплоидный набор хромосом с локализованными в нем
генами. В более широком понимании это совокупность ядерных элементов генетической конституции организма.
ГЕНОТЕРАПИЯ (Gene therapy) – лечение наследственной болезни прямым воздействием на ген.
ГЕНОТИП (Genotype) – конкретный набор генов особи.
ГЕНОФОНД (Gene pool, genofond)– совокупность генов
популяции.
ГМО (GMO) – генетически модифицированные организмы
ГОРИЗОНТАЛЬНЫЙ ПЕРЕНОС ГЕНОВ (Horizontal
gene transfer) – механизм передачи генов между одновременно существующими организмами.
ЗИГОТА (Zygote) – оплодотворенная яйцеклетка.
ЗАТРАВКА (Primer) – короткая последовательность
(часто это РНК), комплементарно взаимодействующая с одной из цепей ДНК; образует свободный 3-ОН-конец, используя который ДНК-полимераза начинает синтез дезоксирибонуклеотидной цепи.
ИНВЕРТИРОВАННЫЕ ПОВТОРЫ (Inverted repeats, IR)
– две копии одной и той же последовательности ДНК в составе одной молекулы, находящиеся в противоположной ориентации. Прилежащие друг к другу инвертированные повторы
образуют палиндром.
ИНТРОН (Intron)– транскрибируемый участок ДНК, который удаляется из состава транскрипта при сплайсинге; в
результате последовательности, находящиеся по обе стороны
от интрона (экзоны), объединяются.
КАЛЛУС – ткань, возникшая in vivo или in vitro путем
неорганизованной пролиферации клеток растений и эксплантов.
КЛОНИРОВАНИЕ (Cloning) – получение генетически
100
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]