Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Молекулярная биотехнология. Учебно-методическое пособие
.pdf
ром соответствующих носителей и методов иммобилизации
можно всегда поддерживать оптимальные условия (рН среды,
температурный режим, стабильность фермента при денатурирующих воздействиях) для проявления максимальной активности фермента.
Иммобилизация фермента - это методический прием,
при котором молекулу биокатализатора включают в какуюлибо фазу, отделенную от фазы свободного раствора, но способную обмениваться с ней молекулами субстрата, эффектора
или ингибитора.
Способы иммобилизации
Существует два основных способа иммобилизации ферментов: физический и химический.
Физическая иммобилизация ферментов представляет собой включение фермента в такую среду, в которой для него
доступной является лишь ограниченная часть общего объема.
При физической иммобилизации фермент не связан с носителем ковалентными связями. Существует четыре типа связывания ферментов:
- адсорбция на нерастворимых носителях;
- включение в поры геля;
- пространственное отделение фермента от остального
объема реакционной системы с помощью полупроницаемой
перегородки (мембраны);
- включение в двухфазную среду, где фермент раство-
рим и может находиться только в одной из фаз.
Главным отличительным признаком химических методов иммобилизации является то, что путем химического
взаимодействия на структуру фермента в его молекуле создаются новые ковалентные связи, в частности между белком
и носителем. Препараты иммобилизованных ферментов, полученные с применением химических методов, обладают, по
61
крайней мере, двумя важными особенностями. Во-первых,
ковалентная связь фермента с носителем обеспечивает высокую прочность образующегося конъюгата. Во-вторых, химическая модификация ферментов способна приводить к существенным изменениям их свойств, таких как субстратная специфичность, каталитическая активность и стабильность.
Применение иммобилизованных ферментов
Иммобилизованные ферменты можно использовать,
главным образом, в трех направлениях:
1. Использование в качестве терапевтических средств.
Такие средства применяются либо в том случае, когда необходимый фермент отсутствует в тканях, вследствие генетических или других нарушений, либо в качестве агентов, разрушающих нежелательные компоненты.
2. Аналитические исследования различных химических
и биологических веществ, как в живом организме, так и в
объектах окружающей среды.
3. Применение в различных производствах. Иммобилизованные ферменты широко используются в бумажной, текстильной, химической и фармацевтической промышленности,
а также для обработки сточных вод и др.
Опыт 1. Иммобилизация каталазы эритроцитов
и изучение ее активности.
Реактивы, оборудование. Перекись водорода, 2%-ный
раствор. Фильтровальная бумага. Пробирки. Кровь.
А) Иммобилизацию путем адсорбции фермента на
фильтровальной бумаге.
Ход работы. Лист фильтровальной бумаги высотой 2 см
складывают гармошкой и помещают в пробирку. В эту же
пробирку вносят 5 капель крови и 5 мл дистиллированной
воды. В пробирке происходит гемолиз эритроцитов. Для ад-
62
сорбции каталазы пробирку тщательно встряхивают в течение 3 минут. Дают отстояться, затем надосадочную жидкость
сливают, а содержимое пробирки дважды промывают дистиллированной водой. Для определения активности фермента
каталазы в пробирку вносят 5 мл 2 %-ной перекиси водорода.
Образование пузырьков свидетельствует об активности
фермента каталазы.
Б) Иммобилизацию путем адсорбции фермента на кусочках мела
В фарфоровую ступку помещают кусочек мела, диаметром примерно 1 см. Добавляют 5 капель крови и тщательно
растирают. В полученную смесь добавляют 5 мл дистиллированной воды. Перемешивают и переносят в центрифужную
пробирку. Пробирку помещают в центрифугу и центрифугируют при 3000 об/мин. в течение 5 минут. Надосадочную
жидкость сливают, осадок промывают дистиллированной водой и снова центрифугируют. Наличие активности фермента
каталазы наблюдают при внесении 3 мл 2%-ной перекиси водорода.
В) Иммобилизовация каталазы на активированном угле
Данная работа является простейшим способом доказательства того, что ферменты после иммобилизации, при соответствующих условиях среды, не теряют свою каталитическую активность.
Реактивы, оборудования
Таблетки активированного угля, свежевзятая кровь, физиологический раствор, 2%-й раствор перекиси водорода,
ступки, центрифуга.
63
Ход работы.
Берут 2 таблетки активированного угля и растирают их в
ступках, затем в одну из ступок добавляют 3 капли крови и
еще раз растирают. После 10 минутной адсорбции фермента
эритроцитов крови на активированном угле переносят содержимое обеих ступок в центрифужные пробирки. В обе пробирки добавляют по 2 мл физиологического раствора, перемешивают и центрифугируют в течении 5 минут при 1000
об/мин. После этого вынимают пробирки из центрифуги, сливают надосадочную жидкость, а в осадок добавляют примерно по 1 мл раствора перекиси водорода.
Активность фермента после адсорбции сохраняется, что
видно по поднимающимся кислородным пузырькам, а в контрольной пробирке пузырьков кислорода не наблюдается.
Занятие 2
Иммуноферментный анализ
Метод иммуноферментного анализа (ИФА) был предло-
жен в начале 70-х годов двумя независимыми группами исследователей: Engvall и Perlmann в Швеции, Van Weemen и
Schuur в Нидерландах. Принцип метода заключается в том,
что антиген (АГ) или антитело (АТ), вступающее в иммунную реакцию, метится ферментом и по превращению субстрата ферментом можно судить о количестве вступившего
во взаимодействие компонента реакции АГ – АТ. Чувствительность ИФА чрезвычайно высока и позволяет определять
минимальные количества вещества (нанограммы). Энгвалл и
Пэлманн (Engvall, Perlmann, 1971) предложили сокращенно
называть этот анализ ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent
Assay), что означает фермент-зависимый иммуносорбентный
анализ.
Иммуноферментный анализ, возникший на пересечении
64
иммунохимии и инженерной энзимологии, стал в настоящее
время одним из распространенных методов исследования.
Явные преимущества этого метода, к которым относятся простота выполнения, доступность и стабильность реагентов,
экспрессность и возможность автоматизации для проведения
массовых анализов, обеспечили его прочное положение в
клинической биохимии, при диагностике заболеваний растений и животных, в научных исследованиях. Методы иммуноферментного анализа являются весьма перспективными для
ранней диагностики возбудителей вирусных и микробных
болезней животных и человека, для проведения массовых
эпизоотологических и эпидемиологических обследований,
для определения в организме минимальных концентраций
лекарственных препаратов, токсических веществ и гормонов,
для контроля технологии микробиологической промышленности и наблюдения за окружающей средой. Кроме того,
ИФА показал положительные результаты при диагностике
ряда паразитарных и грибковых заболеваний. Метод иммуноферментного анализа нашел самое широкое применение в
области иммуногистохимии, иммунологии, медицины и ветеринарии. В настоящее время метод твердофазного ИФА используется для определения широкого класса веществ: гормонов, онкомаркеров, лекарственных препаратов в крови
больного (так называемый, мониторинг лекарственных препаратов), наркотиков, бактерий, вирусов и антител против
них. Методами ИФА возможно определение иммуноглобулинов (видовая принадлежность, субклассы, специфичность), а
также идентификация лимфоцитов (субпопуляций).
Благодаря успехам биотехнологии иммуноферментный
анализ интенсивно развивался, поскольку с помощью генной
инженерии были получены в высокоочищенном виде малодоступные антигены, ферменты – маркеры и их конъюгаты с
65
антигенами, а с помощью клеточной инженерии – моноклональные антитела с заданной специфичностью и аффинностью. В настоящее время возникают все новые направления
развития иммуноферментных методов анализа связанные,
главным образом, с использованием различных методoв регуляции ферментативной активности при детектировании
комплексов антиген – антитело.
В настоящее время, благодаря своей невысокой стоимости и экологической безопасности, методы иммуноферментного анализа перешли в разряд стандартных в практике лабораторных исследований. В целях обнаружения в биологических объектах различных антигенов и антител разработаны и
продолжают разрабатываться различные иммуноферментные
тест-системы. Выпускаются наборы реактивов по практическому применению данных тест-систем. Разработаны тестсистемы иммуноферментные для выявления антител и антигенов при многих бактериальных и вирусных инфекциях человека и животных: классической чумы свиней, бруцеллезе
крупного рогатого скота, бешенстве, сибирской язве, хламидийной инфекции, инфекционном ринотрахеите, гепатите А,
В, С, ВИЧ-инфекции и др. Разработаны тест-системы иммуноферментные для диагностики аллергических и иммунопатологических состояний, т.е. для определения ревматоидного
фактора и иммуноглобулина Е в сыворотке крови; тестсистемы для количественного определения практически всех
гормонов. На определение уровня прогестерона в крови, например, основывается тест-система иммуноферментная для
ранней диагностики стельности коров.
С точки зрения способа выполнения все методы иммуноферментного анализа подразделяются на 2 группы:
1. Иммуноанализ с разделением компонентов (гете-
рогенные методы).
66
2. Иммуноанализ без разделения компонентов (гомо-
генные методы).
Гомогенный анализ.
Методы иммуноферментного анализа без разделения
компонентов, получившие сокращенное название EMIT (Enzyme Multiplied Immunoassay Technique), впервые были разработаны в США в начале 70-х годов (Rubenstein et al., 1972).
В данных системах ферментативную активность анализируемого раствора измеряют без предварительного физического
разделения меченых лигандов на свободные и связанные с
антителами. В основе гомогенного анализа лежит процесс ингибирования активности фермента при специфическом взаимодействии конъюгата с антителами. Реакция происходит без
участия твердой фазы.
ИФА без разделения компонентов, в котором используется меченые ферментом лиганды, разработан для ряда лекарственных препаратов применяемых в терапии, токсических веществ и для гормонов. Применение этих методов позволяет провести терапевтический анализ сыворотки крови
(контроль лекарственных препаратов), анализ гормонов, токсикологический анализ сыворотки крови и мочи, токсикологический анализ продуктов растительного и животного происхождения. Анализ проводится очень быстро. Для выполнения одного определения требуется не более 1 минуты. Метод
к тому же очень чувствителен, с его помощью легко определить количество вещества на уровне пикомолей.
В последнее время при постановке ИФА без разделения
компонентов в качестве метки широко используются модуляторы ферментов, коферменты, «ферментативные каналы» и
другие ФЗМ.
Модуляторы ферментов служат универсальными метками для гомогенного иммуноферментного анализа. Чаще всего
67
в ИФА используются следующие классы модуляторов:
1.Макромолекулярные ингибиторы. Например, авидин –
гликопротеид, выделенный из яичного белка. Он способен
инактивировать биотинзависимые ферменты. Очень часто в
качестве макромолекулярного ингибитора фермента используются антитела против этого же фермента.
2.Низкомолекулярные обратимые ингибиторы фермен-
тов. Например, метотрексат – очень мощный ингибитор дегидрофолатредуктазы.
3. Низкомолекулярные необратимые ингибиторы фер-
ментов. Например, фосфанатный ингибитор ацетилхолинэстеразы.
ИФА без разделения компонентов с использованием
«ферментных каналов» является наиболее перспективным в
практическом применении данного метода. В иммуноанализе
на основе «ферментных каналов» используют два фермента,
катализирующих последовательные реакции, причем продукт
реакции с участием первого фермента служит субстратом для
второго.
Принципы гомогенного иммуноанализа на основе «ферментных каналов» успешно перенесены в иммунохимический
анализ с применением твердой полимерной матрицы (индикаторные полоски), что позволяет проводить экспресс анализы «на местах».
В этом случае экспериментатору нужно только погрузить индикаторную полоску в исследуемый раствор на заданное время и затем оценить результаты реакции визуально или
с помощью прибора.
На основе сочетания иммунокапиллярной миграции и
принципа «ферментативных каналов» создан метод иммуноферментативной хроматографии, который позволяет визуально определять количество антигена в исследуемых образцах
68
по высоте окрашенного фронта на полоске иммунореактивной бумаги (Litman, 1985).
Гетерогенный анализ
Методы иммуноферментного анализа разработанные
1971 году двумя группами ученых и названные ELISA, относятся группе гетерогенных методов. В этом случае сначала
отделяют меченые лиганды, связавшиеся с антителами от
свободных и только потом измеряют активность метки в одной из двух фракций. Как правило, при иммуноферментном
анализе с разделением компонентов антиген (АГ) или антитела (АТ) фиксируются на твердой фазе, а непрореагировавшие
компоненты реакции удаляются многократным отмыванием.
В связи с этим их ещѐ называют твердофазными методами
ИФА. В качестве твердой фазы используются водонерастворимые полимерные материалы (полистироловые планшеты).
Одним из важных достоинств твердофазного ИФА является то, что практически все виды антигенов можно иммобилизовать на твердофазном носителе: белки (иммуноглобулины), энтеротоксины, гликопротеиды, полисахариды и др. Это
делает потенциально возможным обнаружение всех видов
антигенов с использованием данного вида иммуноферментного анализа. Другим важным преимуществом твердофазного
ИФА является возможность длительного сохранения фиксированных на поверхности полистироловых планшет антител
и антигена, что имеет большое значение для использования
метода в практических целях.
Методы гетерогенного иммуноферментного анализа
подразделяются на два типа – это методы так называемого
последовательного или неконкурентного и конкурентного
анализа.
69
Конкурентный ИФА с разделением компонентов.
При конкурентном гетерогенном анализе присутствующие в реакционной среде одновременно меченые ферментом
лиганды (Л-Ф) и лиганды анализируемого образца (Л) вступают в конкурентное взаимодействие с иммобилизованными
на твердом носителе антителами ( I-АТ) или антигенами. После кратковременной инкубации избыток несвязавшихся
компонентов отмывают и в систему добавляют соответствующий хромогенный субстрат. Ферментативная активность
твердой фазы обратно пропорциональна концентрации определяемого лиганда.
Неконкурентный ИФА с разделением компонентов.
Методы неконкурентного иммуноферментного анализа
подразделяются на прямой ИФА, непрямой ИФА и как разновидность непрямого метода «сэндвич – ИФА» или метод
двойных антител.
Прямой метод ИФА. Основан на прямом взаимодействии энзим-меченых специфических антител с адсорбированным на полистироле антигеном или на взаимодействии энзим-меченых антивидовых антител с адсорбированными на
полистироле антителами. По принципу выполнения такие
методы неконкурентного ИФА представляют собой различные модификации конкурентного метода. При этом вместо
совместной инкубации меченых и немеченых антигенов со
связанными антителами инкубируют только стандартный или
анализируемый антиген, а затем после отмывания проводят
инкубацию с избытком энзим-меченых антигенов, который
взаимодействует с «незанятыми» антителами. Проявление
реакции осуществляется введением в систему субстратной
смеси. Концентрация продукта ферментативной реакции обратно пропорциональна концентрации анализируемого антигена.
70
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]