Молекулярная биотехнология. Учебно-методическое пособие

Хотелось бы особо подчеркнуть, что положительный результат теста показывает только наличие в исследуемом образце (обычно сыворотке крови больного) антител (AТ), способных связываться с поверхностными антигенами (AГ), сорбированными на твердой фазе. Результат анализа может существенно зависеть от свойств самой тест-системы и от особенностей иммунного ответа больного. Тест-системы на основе моноклональных антител позволяют достигать более высокой чувствительности и избирательности. Однако чрез­мерно узкая избирательность может приводить к ложноотри­цательным результатам при некоторых особенностях иммун­ного ответа организма больного. Многое зависит от того, ка­кого рода AГ используется для сорбции на твердой фазе. Важна и степень очистки, и количество различных AГ, дос­тупных для образования иммунных комплексов.

Сэндвич – ИФА пригоден для количественного опреде­ления веществ, содержащих много антигенных детерминант, например для антител, ревматоидных факторов, полипептид­ных гормонов, белков, бактериальных и вирусных антигенов.

Компоненты реакции ИФА и оборудования. Для выполнения традиционного твердофазного ИФА не-

обходимо следующее: пробы анализируемых специфических антител или антигенов, положительный и отрицательный контроли (набор сывороток, антигенов), иммуноноситель (полистироловый планшет), конъюгат (антитело или антиген, меченые ферментом), буферные растворы для разведения ан­тигена и антител, конъюгата и субстрата, ингредиенты суб­стратной смеси промывочная жидкость, стоп реагент. Авто­матические или полуавтоматические, одноканальные и мно­гоканальные пипетки и дозаторы фиксированного или пере­менного объема. Спектрофотометр.

43 мл 1 М раствора фосфорнокислого калия двузамещенного (К2НРО4) и 7 мл раствора фосфорнокислого калия однозаме­щенного (КН2РО4), объем доводят до 5 л дистиллированной водой, затем добавляют 29 г хлористого натия.

В большинстве случаев антиген разводится в 0,01 М карбонатно-бикарбонатном буфере с рН-9,6. Раствор антиге­на вносится в лунки планшета в объеме 100мкл. Время инку­бации составляет 12 часов при комнатной температуре или 2 часа при 370С.

В случае, когда антиген иммобилизируется на носителе методом физической адсорбции необходимо блокировать возможные "«свободные места"» в лунках, чтобы избежать адсорбцию анализируемых антител при дальнейших инкуба­циях. Неспецифическое связывание антител и конъюгата с твердой фазой является основной причиной «фоновой актив­ности» ИФА. Для этого в лунки планшета вносят не менее 200 мкл раствора бычьего сывороточного альбумина (БСА) или яичного альбумина в 0.01М фосфатно-солевом буфере с твином, рН – 7,3 (ФСБ-Т). Время инкубации 1 час при 370С. После этого раствор альбумина удаляют и лунки планшет промывают ФСБ-Т. Иммобилизованный на полистироле ан­тиген сохраняет свою активность. Срок годности иммуноло­гических планшет при температуре от 2 до 5 0С составляет до одного года, что является одним из важных условий при соз­дании наборов препаратов иммуноферментных диагностиче­ских тест – систем.

ются основным компонентом при выполнении реакции, включающимися в еѐ цикл при разбавлении специфических сывороток, конъюгата и др. и являющимися составной ча­стью отмывающей жидкости. Применение детергентов в им­муноферментном анализе должно исключать денатурацию белка, перенос заряда в водных растворах и обеспечивать снижение контакта белка с неполярной твердой фазой. При выполнении твердофазного ИФА рекомендуются неионоген­ные детергенты типа – Тритон Х-100, Твин-20, 40, 80.

сильное подсушивание могут привести к искаженным резуль­татам.

Конъюгат – комплекс антитела или антигена с фермент – зависимой меткой (ФЗМ). В твердофазном ИФА более широ­ко используются ферментные конъюгаты. Особое значение в ИФА следует придавать активности конъюгата, стабильности и сроков его годности.

фирмы выпускают различные виды конъюгатов для поста­новки ИФА, в т.ч. и пероксидазные.

Субстратная смесь или раствор субстрата готовится не­посредственно перед употреблением. Хромоген растворяется в цитратном буфере из расчета 9 мг на 10 мл буфера и добав­ляется 0,3 мл 3% раствора Н2О2.

Реакция останавливается добавлением в лунки планшет по 50 мкл стоп-реагента, который представляет собой 2н рас­твор серной кислоты. После добавления стоп-реагента со­держимое лунок необходимо перемешать осторожным посту­киванием по краям планшета. Измерение производить через несколько минут.