Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Молекулярная биотехнология. Учебно-методическое пособие
.pdf
Опыт 1. Рестрикция ДНК
Оптимальные предельные условия работы каждой рестриктазы описаны в каталогах и на сайтах фирм – производителей ферментов. Исходя из этих сведений, для составления
реакции рестрикции выбирается буфер (как правило, наиболее походящий буфер поставляется фирмой вместе с рестриктазой, в отдельной пробирке), температура проведения реакции и необходимость добавления в реакцию сопутствующих
веществ (например, бычий сывороточный альбумин). Ниже
даны схема проведения гидролиза и состав реакционной смеси для расщепления плазмидной ДНК рестриктазой BamHI
(«СибЭнзим»).
Материалы и оборудование:
Центрифуга Eppendorf; магнитная мешалка; автоматические пипетки (0,1–10 мкл, 10–100 мкл, 1 мл), наконечники
универсальные; мерные цилиндры, колба мерная; пробирки
пластиковые «Eppendorf» объемом 1,5 мл универсальные,
штатив для микропробирок на 1,5–2 мл, образцы ДНК,
MgCl2, Tris-HCl, дистиллированная вода, NaCl, DTT, фермент BamHI, перчатки латексные.
Ход работы.
Приготовить необходимый набор посуды, инструментов
и материалов в лаборатории. Для проведения реакции гидролиза ДНК предварительно подготовить реакционную смесь,
суммарный объем которой составляет 100 мкл. Для этого к 20
мкг ДНК добавить 10 мкл буфера SE-G (состав буфера: 10
мM Tris-HCl (pH = 7,6 при 25°C); 10 мM MgCl2; 50 мM NaCl;
1 мM DTT), 3–5 ед. а. фермента BamHI и довести объем дистиллированной водой до 100 мкл. Смесь перемешать на
«vortexе», центрифугировать в течение 5 с при 8 000 об./мин
и инкубировать в термостате в течение 1 ч при 37°С. Все операции проводить на лабораторном столе, ферменты либо по-
11
местить в лед, либо кратковременно извлекать из морозильной камеры. Для контроля полноты проведения гидролиза
провести электрофорез в агарозном геле.
Опыт 2. Неденатурирующий электрофорез нуклеиновых
кислот в агарозном геле
Электрофорез ДНК — это аналитический метод, применяемый для разделения фрагментов ДНК по размеру и форме.
Для электрофоретического анализа ДНК обычно используют
агарозные (для относительно длинных молекул ДНК) и полиакриламидные (для высокого разрешения коротких молекул
ДНК, например, в случае секвенирования) гели.
Рис. 3. Системы для электрофореза в агарозном геле.
Материалы и оборудование:
Агароза; 1Х Трис-ацетатный буфер (ТАЕ): (40 мМ Трисацетат, рН 7,8-8,0, 1 мМ ЭДТА); концентрированный раствор
бромистого этидия, 10 мг/мл (хранить при +4°C в темной
склянке); буфер для нанесения проб (10 мМ Трис-HCl, pH
7,8; 0,025% бромфеноловый синий; 0,025% ксиленцианол;
30% глицерин; 25 мМ ЭДТА); маркер молекулярных длин
ДНК (Евроген, NL001); камера для агарозного гель-
12
электрофореза; лоток для геля (20 х 10 см), бортики для геле-
Концентрация ага-
розы, %
Размеры фрагментов,
т.п.о.
0,6
20 и более
0,8
9 - 0,7
1,0
7 - 0,5
1,5
4 - 0,2
2,0
3 - 0,1
вого лотка, гребенку; источник постоянного тока; весы; трансиллюминатор; система гель-документации; стеклянная колба; пробирки (1,5 или 0,2 мл); стерильные наконечники для
пипеток; автоматические пипетки на 10-20, 200 и 1000 мкл;
перчатки.
Ход работы.
Электрофорез проводят в трис-ацетатном (1Х ТАЕ)
электродном буфере, в который добавляют бромистый этидий
до конечной концентрации 0.3 мг/л. Этот же буфер используют для приготовления геля.
1) Установите лоток для геля строго горизонтально. Укрепите бортики для гелевого лотка. Вставьте у одного из концов геля гребенку для формирования стартовых лунок. Гребенка не должна упираться в дно лотка, на котором формируется блок геля. Зазор между дном лунки и основанием геля
должен составлять 0,5-1 мм.
2) Взвесьте необходимое количество агарозы. Области
эффективного разделения линейных молекул ДНК разного
размера в зависимости от концентрации агарозы в геле приведены в таблице:
Таблица 1. Области эффективного разделения линейных
молекул ДНК в зависимости от концентрации агарозы в геле.
3) Поместите навеску агарозы в стеклянную колбу, за-
13
лейте свежеприготовленным 1X TAE буфером, содержащим
бромистый этидий, и прогрейте колбу для растворения агарозы. Во избежание пригорания агарозы нагревание лучше проводить в кипящей водяной бане или в СВЧ печи.
4) После полного растворения агарозы остудите раствор
приблизительно до +50°C. Залейте теплый раствор агарозы в
лоток так, чтобы толщина слоя агарозы составляла 4-5 мм.
5) После полного затвердения геля (20-30 мин при комнатной температуре, значительно быстрее на +4°C) аккуратно
удалите гребенку, стараясь не повредить лунки. Удалите бортики и перенесите лоток с гелем в основную камеру.
6) Залейте в камеру свежеприготовленный 1Х ТАЕ буфер, содержащий 0.3 мг/л бромистого этидия, так, чтобы гель
был покрыт слоем буфера на 0,5-1,0 мм.
7) Смешайте образцы ДНК, подлежащие анализу, с 1-2
мкл буфера для нанесения проб, и внесите их в лунки геля.
Наслаивание образцов проводите под буфер. Обычно в лунку
вносят такое количество ДНК, чтобы в индивидуальной полосе было не более 200 нг ДНК. При наличии мощного источника УФ можно увидеть полосы, содержащие 5-10 нг
ДНК. При анализе продуктов ПЦР, как правило, наносят 2-4
мкл пробы.
8) В отдельную лунку внесите 50-100 нг маркера длин
ДНК, смешанного с буфером для нанесения проб. Маркер
длин ДНК используют для определения размера фрагментов
ДНК в образце. Маркер длин ДНК, концентрация которого
известна, также можно использовать для приблизительной
оценки концентрации ДНК в исследуемом образце. В 2-3
лунки наносят несколько последовательно разведенных в 2
раза аликвот ДНК (или, наоборот, делают несколько разведений маркера). Через 1-2 мин после вхождения образцов в гель
(пробег ДНК не далее 4-5 мм от лунок), пока фрагменты мар-
14
кера не успели разделиться и выглядят как одна диффузная
полоса, сравнивают интенсивности свечения исследуемых
образцов и маркера длин.
9) Подсоедините клеммы прибора к источнику питания
(движение образцов ДНК идет в направлении от катода к
аноду, т.е. от «–» к «+»).
10) Включите ток и установите напряжение не более 10
V/см (10 V на каждый см длины между электродами). Контролируйте ход электрофореза по движению красителей.
11) По окончании электрофореза отключите прибор от
сети. Перенесите гель на полиэтиленовую пленку и просмотрите под трансиллюминатором.
Занятие 2
Методы изучения генетического материала.
Полимеразная цепная реакция.
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — эксперимен-
тальный метод молекулярной биологии, способ значительного увеличения малых концентраций определѐнных фрагментов ДНК (клонирование) в биологическом материале.
Метод ПЦР относится к гибридизационным методам
анализа ДНК, основанным на достраивании комплементарной
полинуклеотидной цепи на одинарной полинуклеотидной цепи - матрице. Принцип метода ПЦР был разработан в начале
80-х годов прошлого столетия в США. В настоящее время
метод широко используется в научных исследованиях, в
практическом здравоохранении, в службе Госсанэпиднадзора
и др.
Для проведения ПЦР необходимо наличие в реакционной смеси ряда основных компонентов.
Праймеры – искусственно синтезированные олигонуклеотиды, имеющие, как правило, размер от 15 до 30 нуклеоти-
15
дов, идентичные соответствующим участкам ДНК-мишени.
Они играют ключевую роль в образовании продуктов реакции амплификации. Правильно подобранные праймеры обеспечивают специфичность и чувствительность тест-системы.
Taq-полимераза – термостабильный фермент, обеспечивающий достраивание З'-конца второй цепи ДНК согласно
принципу комплементарности.
Смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов (дНТФ) – дезоксиаденозинтрифосфата (дАТФ), дезоксигуанозинтрифосфата
(дГТФ), дезоксицитозинтрифосфата (дЦТФ) и дезокситимидинтрифосфата (дТТФ) – «строительный материал», используемый Taq-полимеразой для синтеза второй цепи ДНК.
Буфер – смесь катионов и анионов в определенной концентрации, обеспечивающей оптимальные условия для реакции, а также стабильное значение рН.
Анализируемый образец – подготовленный к внесению
в реакционную смесь препарат, который может содержать
искомую ДНК, например, ДНК микроорганизмов, служащую
мишенью для последующего многократного копирования.
При отсутствии ДНК-мишени специфический продукт амплификации не образуется.
Для удобства детекции или контроля эффективности амплификации в состав реакционной смеси могут быть включены дополнительные компоненты. Внутренние контроли – гетерологичный специфическому фрагмент ДНК, как правило,
большего размера, ограниченный (фланкированный) специфическими праймерами. Фактически, представляет собой
альтернативную матрицу ПЦР и позволяет контролировать
эффективность амплификации в каждой конкретной пробирке. ДНК-зонды – искусственно синтезированные олигонуклеотиды небольшого размера (около 30 нуклеотидов), комплементарные специфическим ампликонам (продуктам реакции).
16
Благодаря прикрепленным к ним изотопным или флуоресцентным меткам ДНК-зонды могут использоваться для детекции продуктов реакции.
Основные этапы ПЦР
1) денатурация ДНК (расплетение двойной спирали, рас-
хождение нитей ДНК) при 94—96 °C.
2) отжиг при 68 °C, образование коротких двухцепочеч-
ных участков ДНК (затравок, необходимых для инициации
синтеза ДНК) или связывание нитей ДНК праймерами;
3) элонгация при 72 °C или синтез новой цепи ДНК
(комплементарное достраивание обеих нитей);
Эти стадии повторяются 30-40 раз. В результате выбранный локус ДНК тиражируется миллионы раз (из одного
локуса амплифицируется до 108 молекул данного локуса
ДНК).
Таким образом, в основе метода ПЦР лежит многократ-
ное удвоение определѐнного участка ДНК при помощи ферментов in vitro. В результате нарабатывается количество
ДНК, достаточное для визуальной детекции. Кроме простого
увеличения числа копий ДНК (этот процесс называется амплификацией), ПЦР позволяет производить множество других манипуляций с генетическим материалом. Широко используется в биологической и медицинской практике, например, для диагностики заболеваний (наследственных, инфекционных), для установления отцовства, для клонирования генов, введения мутаций, выделения новых генов. В ветеринарии можно выделить несколько направлений в разработке
ДНК-технологий:
1. Разработка молекулярных методов контроля качества сельскохозяйственного сырья и продуктов питания.
2. Тотальное генотипирование организмов, создание генетических паспортов ородгенет таксономических групп.
17
3. Выявление генетических заболеваний на ранних стадиях
развития.
4. Исследование генома сельскохозяйственных животных на
наличие продуктивных качеств для решения селекционных
задач.
5. Диагностика инфекционных заболеваний сельскохозяйственных животных и проведение эпизоотологического мониторинга.
Стадии постановки ПЦР
ПЦР-анализ состоит из трех стадий.
1. Подготовка пробы биологического материала;
2. Постановка ПЦР;
3. Детекция результатов ПЦР.
1. Для подготовки пробы к постановке ПЦР используют
различные методики в зависимости от поставленных задач.
Их суть заключается в экстракции (извлечении) ДНК из биопрепарата и удалении или нейтрализации посторонних примесей для получения препарата ДНК с чистотой, пригодной
для постановки реакции амплификации. Иногда достаточным
бывает кипячение образца в течение 5–10 минут, однако в
большинстве случаев требуются более трудоемкие методы.
Стандартной и ставшей уже классической считается методика
получения чистого препарата ДНК, предложенная Marmur.
Она включает в себя ферментативный протеолиз клеток с последующей депротеинизацией и переосаждением ДНК спиртом.
Популярным в настоящее время является метод выделения ДНК, предложенный Boom с соавт. Он основан на использовании для лизиса клеток реагента – гуанидина изотиоционата (GuSCN) с последующей сорбцией ДНК на специальном носителе. После отмывок в пробе остается ДНК, сор-
18
бированная на носителе, с которого она легко снимается с
помощью элюирующего буфера. Метод удобен и технологичен для подготовки образца к амплификации. Однако возможны потери ДНК вследствие необратимой сорбции на носителе, а также в процессе многочисленных отмывок, что
имеет большое значение при работе с небольшими количествами ДНК в образце.
При массовом скрининге, когда важно получить статистические данные, допускается использование простых методов с применением детергентов или обработки биологического материала щелочами с последующей их нейтрализацией.
2. Способы постановки ПЦР. На данный момент разра-
ботаны варианты постановки ПЦР, направленные на решение
следующих задач: увеличение эффективности реакции и
снижение риска образования неспецифических продуктов;
реализацию возможности проведения как качественного, так
и количественного анализа искомых участков молекулы
ДНК/РНК.
Наиболее распространенными в клиникодиагностических лабораториях модификациями ПЦР являются: ПЦР с «горячим» стартом (hot-start PCR) – модификация,
суть которой состоит в предотвращении возможности начала
реакции до момента достижения в пробирке условий, обеспечивающих специфический отжиг праймеров. Для этого полимеразная активность фермента в момент постановки ПЦР
блокируется антителами или имитирующими антитела небольшими молекулами типа Affibody до наступления первой
денатурации (проводится при 95 °C в течение 10 минут).
Кроме того, для предотвращения преждевременного взаимодействия фермента с компонентами реакционной смеси и, как
следствие, образования неспецифических продуктов реакции
до момента полного прогрева, используется легкоплавкий па-
19
рафин или специальные масла, отделяющие полимеразу от
реакционной смеси.
ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР, RT-PCR) –
используется для амплификации, выделения или идентификации известной последовательности РНК. На первом этапе с
помощью ревертазы (обратной транскриптазы), используя в
качестве матрицы мРНК, проводят синтез одноцепочечной
молекулы ДНК (кДНК), которая используется для последующей ПЦР. Возможность использования РНК в качестве мишени для ПЦР существенно расширяет спектр применения
этого метода, например, геномы многих вирусов (гепатит С,
вирусы гриппа, ВИЧ и т.д.) представлены именно РНК.
ПЦР с анализом результатов «по конечной точке» (Endpoint PCR) – это модификация метода ПЦР, которая позволяет учитывать результаты реакции по наличию флуоресценции
после амплификации, не открывая пробирки. Таким образом,
решается одна из основных проблем ПЦР – проблема контаминации ампликонами. Одним из таких вариантов является
метод «FLASH» (FLuorescent Amplification-based Specific
Hybridization – специфическая гибридизации в процессе амплификации с ДНК-зондами, меченными флуорофорами).
Следует отметить, что регистрация флуоресценции происходит с помощью детектора флуоресценции после окончания
реакции, поэтому метод не является количественным.
ПЦР в режиме «реального времени» (Real-Time PCR,
ПЦР-РВ) – используется для одновременной амплификации и
измерения количества искомой молекулы ДНК. Преимуществом данного подхода является возможность совмещения детекции и количественного определения специфической последовательности ДНК в образце в реальном времени после
каждого цикла амплификации. Для этого используют флуоресцентные красители, интеркалирующие в двуцепочечные
20
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]