Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Молекулярная биотехнология. Учебно-методическое пособие
.pdf
молекулы ДНК. Отличительными чертами ПЦР-РВ являются
не только возможность количественного определения
ДНК/РНК в исследуемом материале, но и отсутствие стадии
электрофореза, что позволяет минимизировать риск контаминации продуктами ПЦР и таким образом резко уменьшить
число ложноположительных результатов.
Возможны и другие варианты ПЦР, получившие наибольшее распространение в научно-исследовательских лабораториях, например: Гнездовая («вложенная», англ. nested
PCR) ПЦР – применяется для уменьшения числа побочных
продуктов реакции. Используют две пары праймеров и проводят две последовательные реакции. Вторая пара праймеров
амплифицирует участок ДНК внутри продукта первой реакции. ПЦР «инвертированная» – используется в том случае,
если известен лишь небольшой участок внутри нужной последовательности. Этот метод полезен, когда нужно определить соседние последовательности после вставки ДНК в геном. ПЦР длинных фрагментов (англ. Long-range PCR) – вариант ПЦР для амплификации протяженных участков ДНК
(10 тысяч и более оснований). Для реализации данного подхода используют смесь двух полимераз, одна из которых –
Taq-полимераза с высокой процессивностью (способная за
один проход синтезировать длинную цепь ДНК), а вторая –
ДНК-полимераза с 3'-5' экзонуклеазной активностью (Pfuполимераза). Групп-специфическая ПЦР (англ. group-specific
PCR) – ПЦР с использованием консервативных праймеров к
последовательностям ДНК для родственных групп внутри
одного или между разными видами. ПЦР с быстрой амплификацией концов кДНК (RACE-PCR), иммуно-ПЦР (immunoPCR-IPCR) и др.
3. Детекция результатов ПЦР. На сегодняшний день су-
ществует несколько основных способов детекции результатов
21
ПЦР:
1). Электрофоретический (в агарозном или полиакрила-
мидном геле);
2). Гибридизационно – ферментный;
3). Гибридизационо – флуоресцентный.
Наиболее распространенным до недавнего времени являлся метод электрофореза, основанный на разделении молекул ДНК по размеру (рис. 4).
Рис.4. Агарозный гель-электрофорез фрагментов ДНК,
полученных в результате ПЦР
В этом случае визуализацию результатов проводят в
пластине агарозного геля с добавлением специального красителя ДНК, например бромистого этидия. Застывшая агароза
образует пространственную решетку. После окончания электрофореза, продолжающегося от 10 мин до 1 часа, гель помещают на фильтр трансиллюминатора, который излучает
свет в ультрафиолетовом диапазоне (254 – 310 нм).
Метод гибридизации после амплификации основан на
гибридизации олигонуклеотидных зондов с продуктами ам-
22
плификации. Зонды представляют собой искусственно синтезированные участки ДНК, содержащие ту или иную метку,
детектируемую специальными приборами – детектор флуоресценции. Детектор регистрирует флуоресцентное излучение, возникающее в реакционной смеси при освещении образца источником возбуждающего света. Детекция результатов проводится в закрытых пробирках, что позволяет осуществлять ПЦР-исследования в одной комнате и обходиться
меньшим количеством персонала. Кроме того, регистрация,
интерпретация и хранение полученных результатов проводятся автоматически.
Из гибридизационно – ферментных методов для выявления продуктов амплификации наиболее распространенный
подход - выщепление 5' концевой метки. Метод основан на
использовании 5'-экзонуклеазной активности полимеразы. В
реакционную смесь добавляют ДНК-зонды, в состав которых
входят флуоресцентная метка в 5'-положении, гаситель флуоресценции в 3'-положении, а также фосфатная группа в 3'положении. Эти зонды имеют места посадки внутри амплифицируемой области. Гаситель поглощает испускаемое флуоресцентной меткой излучение, а фосфатная группа в 3'положении блокирует полимеразу. В ходе ПЦР во время стадии отжига праймеров происходит присоединение ДНК-зонда
к комплементарной цепи ДНК, причем, чем больше продуктов амплификации образуется в ходе ПЦР, тем больше молекул зондов свяжется с соответствующими ампликонами. Следовательно, что чем больше ампликонов, тем интенсивнее
будет свечение.
Главным преимуществом детекции результатов ПЦР в
режиме «реального времени» является возможность проведения количественного анализа. При количественном исследовании образцов каждая серия экспериментов сопровождается
23
постановкой амплификации с контрольными образцами, в
которых заведомо известно количество копий ДНК (калибровочные образцы). Сравнение кинетики накопления продуктов
амплификации в экспериментальных и контрольных образцах
позволяет оценить концентрацию ДНК в диапазоне разведений контрольных препаратов ДНК.
Занятие 3
Алгоритм создания генно-инженерного продукта.
Генная инженерия – технология рекомбинантных ДНК.
Под рекомбинантными понимают ДНК, образованные объединением in vitro (в пробирке) двух или более фрагментов
ДНК, выделенных из различных биологических источников.
Получение рекомбинантных ДНК состоит из нескольких
этапов:
1). выделение нужного (целевого) гена;
2). встраивание его в генетический элемент, способный к
репликации (вектор);
3). введение вектора в организм-реципиент;
4). идентификация (скрининг) и отбор клеток, которые
приобрели желаемый ген или гены.
Получение генов
Выделение генов – один из главных этапов в генетической инженерии. В принципе существует два основных способа получения гена: синтез и выделение из ДНК.
Синтез гена осуществляется 2-мя путями – химикоферментативный синтез и синтез с помощью обратной транскриптазы.
Химико-ферментативный синтез гена.
Впервые химико-ферментативный синтез гена был осуществлен в конце 60-х – в начале 70-х годов XX века индийским ученым Н. Кhorana, работавшим в США и который был
24
удостоен Нобелевской премии в 1968 г.
Химико-ферментативный синтез генов выполняется в
двух стадиях: 1) химический синтез коротких, состоящих из
8-16 нуклеотидов одноцепочечных фрагментов ДНК - олигонуклеотидов. 2) полученные олигонуклеотиды сшиваются
между собой с помощью фермента ДНК-лигазы. Из одноцепочечных олигонуклеотидов формируют двухцепочечную
цепь ДНК.
Химико-ферментативный синтез ДНК используют не
только для полного синтеза структурных генов, но и для присоединения к ним регуляторных участков (промоторов, участков связывания РНК с рибосомой), а также последовательностей, необходимых для соединения полученных генов с
векторными молекулами.
Данный способ является трудоемким и весьма сложным.
Преимуществом его являются то, что позволяет точно воссоздать необходимую последовательность нуклеотидов. Кроме того, в процессе синтеза можно ввести различные регуляторные последовательности или участки узнавания различных рестриктаз и т. д. Этим методом получены гены соматостатина, А- и В- цепи инсулина, проинсулина и другие.
Синтез генов с помощью обратной транскрипции
Используя реакцию обратной транскрипции, при помощи ферментов ревертаз (обратные транскриптазы), можно
синтезировать практически любой ген в присутствии соответствующих мРНК. Методы выделения последних достаточно
хорошо разработаны.
Данный метод основан на универсальной способности
обратных транскриптаз синтезировать двунитевую ДНК на
однонитевых РНК-матрицах. Функционирование обратных
транскриптаз нуждаются лишь в наличии короткой затравочной олигонуклеотидной последовательности РНК или ДНК,
25
комплементарной РНК – матрице (затравка – праймер).
Выделение гена из ДНК
Выделение генов из естественных источников является
сложнейшей задачей, так как из многих тысяч генов, имеющихся в геноме клетки, нужно выделить единственный конкретный ген, контролирующий развитие того или иного признака. Для этого необходимо точно знать расположение гена
и произвести его вырезание при помощи соответствующих
ферментов-рестриктаз.
Генетический вектор
Генетический вектор – это молекула ДНК или РНК, которые способны переносить в клетку чужеродную ДНК,
обеспечить еѐ амплификацию и интеграцию в геном.
По профилю использования векторы бывают:
1. Векторы для клонирования – используются для ам-
плификации фрагмента ДНК, встроенного в вектор посредством еѐ репликации.
2. Экспрессионные векторы – для наработки определен-
ного белка, а также для анализа генома и его продуктов.
3. Векторы для трансформации – служат для введения
чужеродного фрагмента ДНК в геном реципиента.
В настоящее время широко применяются, в качестве
прокариотических векторов - плазмиды, бактериофаги, а в
качестве эукариотических - вирусы животных и растений, а
также искусственно сконструированные векторы, способные
реплицироваться как в бактериальных, так и в эукариотических клетках (челночные векторы).
Плазмиды - это внехромосомные генетические элементы
про- и эукариот, которые автономно реплицируются в клетках.
Бактериальные плазмиды делятся на два класса. Одни
плазмиды (например, хорошо изученный фактор F, опреде-
26
ляющий пол у E.coli) сами способны переходить из клетки в
клетку, другие такой способностью не обладают. По ряду
причин, и прежде всего для предотвращения неконтролируемого распространения потенциально опасного генетического
материала, подавляющее большинство бактериальных плазмидных векторов создано на основе плазмид второго класса.
Важнейшим компонентом вектора является его репликон - элемент, от которого зависит автономное размножение
вектора в клетке-хозяине. Чтобы получить плазмидный вектор, необходимо объединить репликон с генами, которые допускали бы возможность селекции (генетические маркеры).
Гены, кодирующие резистентность к антибиотикам, оказались наиболее полезными для этой цели.
Рис.5. Плазмидный вектор E.coli – pBR 322.
Бактериофаги - группа вирусов, паразитирующих в бактериальных клетках. Они широко распространены в природе
— их выделяют из воды, почвы, организмов различных животных и человека.
Большинство фагов относится к ДНК-содержащим вирусам с нуклеокапсидом, организованным по принципу смешанной симметрии.
Среди фаговых векторов наиболее удобные системы
27
созданные на базе геномов бактериофага λ и М13 E.coli. ДНК
этих фагов содержит протяженные области, которые можно
заменить на чужеродную ДНК, не затрагивая их способности
реплицироваться в клетках E.coli. При конструировании векторов на базе ДНК фага из нее сначала (путем делений коротких участков ДНК) удаляют многие сайты рестрикции из области, не существенной для репликации ДНК, и оставляют
сайты, предназначенные для встраивания чужеродной ДНК.
В эту же область часто встраивают маркерные гены, позволяющие отличить рекомбинантную ДНК от исходного вектора.
На основе бактериофага λ можно сконструировать векторы емкостью до 25 т.п.н.
Существуют гибридные вектора, содержащие ДНК фага
и плазмиды. К ним относятся, например, космиды и фазмиды.
Векторы на основе РНК-содержащих вирусов.
РНК содержащие вирусы, или ретровирусы
(Retroviridae) легко интегрируют в геном клетки-хозяина, тем
самым обеспечивая долговременную экспрессию необходимого гена. Для создания генно-терапевтических векторов они
считаются наиболее перспективными.
Попадая внутрь клетки, ретровирусная РНК превращается в ДНК путем хорошо теперь известного процесса обратной
транскрипции. Эта ДНК встраивается в геномную ДНК и с
этого момента становится неотъемлемой частью генома клетки. Таким образом, инфицирование организма ретровирусами
– это своего рода естественно-природный механизм генетической модификации клетки.
Основные преимущества применения РНК-вирусных
векторов — эффективная доставка генетического материала в
клетки, поддержка долговременной экспрессии и трансдукция неделящихся клеток (большинство РНК-векторов неспо-
28
собно к эффективному переносу трансгенов в покоящиеся
клетки).
Сверхъѐмкие векторы
Исследование генов в хромосомах высших растений,
животных и человека потребовало создания векторов для
клонирования фрагментов ДНК длиной в несколько сотен
тысяч пар оснований. Этим требованиям отвечает система
для клонирования сверхдлинных молекул ДНК на основе искусственно полученной минихромосомы дрожжей - YAC
(yeast artificial chromosome). YAC-вектор представляет собой
кольцевую молекулу ДНК, содержащую ряд генетических
элементов, которые позволяют ей существовать во внехромосомном состоянии в клетках дрожжей. В таком векторе удавалось осуществлять клонирование фрагментов ДНК длиной
до 700 т.п.н.
Для преодоления трудностей, возникающих при использовании искусственных хромосом дрожжей, были сконструированы альтернативные векторные системы, среди которых наиболее популярными в настоящее время являются
системы, основанные на искусственных хромосомах бакте-
рий – BAC (bacterial artificial chromosome).
Искусственные хромосомы животных (MAC) и человека
(HAC). При конструировании сверхъемких векторов такого
рода используются разные методики – конструирование методом «сверху вниз» и методом «снизу вверх».
Стратегия конструирования методом «сверху вниз» основана на последовательном укорачивании природных хромосом с сохранением их элементов, обеспечивающих репликацию и митотическую сегрегацию. При конструировании
методом «снизу вверх» искусственную минихромосому собирают из отдельных последовательностей, соответствующих теломерам, центромерам и областям начала репликации
29
природных хромосом, с которыми объединяют требуемую
рекомбинантную ДНК.
Конструирование рекомбинантных ДНК
Под рекомбинантными понимают ДНК, образованные
объединением in vitro двух или более фрагментов ДНК, выделенных из различных биологических источников.
Как известно, фрагменты ДНК, в том числе и фрагменты
содержащие гены, получают в основном с использованием
рестриктаз. Рестриктазы могут образовывать фрагменты как с
тупыми, так и с липкими концами. Сшивка фрагментов ДНК
возможна тремя основными методами, зависящими от того,
какие концы имеют фрагменты сшиваемых ДНК:
- сшивка по одноименным "липким" концам (рестрик-
тазно лигазный метод);
- сшивка по "тупым" концам (коннекторный метод);
- сшивка фрагментов с разноименными липкими конца-
ми.
Сшивка по одноименным "липким" концам
(рестриктазно лигазный метод)
Этот метод является самым распространенным и популярным. Впервые этим способом гибридная ДНК была получена С. Коэном в 1973 году. Суть метода состоит в следующем:
1. Рестриктазой класса II разрезают молекулу ДНК на
фрагменты с липкими (комплементарными) концами.
2. Препараты различных молекул ДНК, гидролизованных одной и той же рестриктазой, смешивают и липкие концы разных фракций соединяются водородными связями по
принципу комплементарности азотистых оснований.
3. С помощью ДНК-лигазы происходит ковалентное связывание фрагментов ДНК. По такой схеме могут быть соединены ковалентно in vitro два и более фрагментов, полученных
30
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]