Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Методы микроскопического анализа в ботанике. Учебно-методическое пособие для студентов биологического факультета, обучающихся по направлению подготовк.pdf
1) спирт 10% – 30 мин,
2) спирт 20% – 30 мин,
3) спирт 30% – 30 мин,
4) спирт 40% – 40 мин,
5) спирт 50% – 1 ч,
6) спирт 60% – 1,5 ч,
7) спирт 70% – от 2–3 ч и до нескольких суток,
8) спирт 80% – 1–2 ч,
9) спирт 90% – 1–2 ч,
10) спирт 95% – 1–3 ч,
11) спирт 100% (абсолютный) – 1–3 ч,
12) смесь 1 (3 части 100% спирта + 1 часть хлороформа) – 1,5 ч,
13) смесь 2 (2 части 100% спирта + 2 части хлороформа) – 1,5 ч,
14) смесь 3 (1 часть 100% спирта + 3 части хлороформа) – 1,5 ч,
15) хлороформ (ксилол или толуол) 1–2 ч,
16) хлороформ (ксилол или толуол) 2–2 ч.
Приготовление спиртов требуемой концентрации описано в разделе 3.4.
Если объект был зафиксирован в фиксаторе Кларка (3 : 1), проводку
через спирты можно начинать с 70% спирта. Из хлороформа 2 объект помещают в фарфоровый тигель (или пенициллиновый пузырек), на дно которого предварительно кладут слой измельченного парафина (можно натереть
на терке). Заливают небольшим количеством хлороформа и засыпают сверху
парафином. Оставляют на 12 ч под вытяжкой, а затем помещают на 2–3 дня
в термостат при 60°С до исчезновения следов хлороформа.
Далее материал должен быть помещен на подставку (деревянный ку-
бик), которая крепится на столике микротома. Тигель (пузырек) с заключенным в парафин материалом разогревают на водяной бане или в термостате.
Берут деревянный кубик и делают на одной из его сторон небольшое возвышение из парафина, постепенно, капля за каплей, пипеткой нанося на деревянный кубик расплавленный парафин. Следует помнить, что следующую
каплю парафина можно наносить только тогда, когда на поверхности предыдущей капли появится матовая пленка. Не рекомендуют давать полностью
остыть каплям, так как впоследствии это может привести к расслоению
парафинового кубика. После того как возвышение слегка затвердеет, на него
переносят объект разогретыми над пламенем спиртовки препаровальными
иглами или пинцетом. Затем на объект вновь каплями наносят парафин.
Когда объект окажется целиком погруженным в парафин, его оставляют
при комнатной температуре до тех пор, пока парафин остынет и затвердеет.
После этого лезвием бритвы придают парафиновому возвышению на деревянной подставке форму куба со строго параллельными гранями.
Поместить материал на деревянную подставку можно и другим спосо-
бом. В разогретую на парафиновом столике и предварительно смазанную
51
глицерином специальную фарфоровую ванночку наливают на 1/3 расплавленного парафина. Дают парафину слегка застыть и горячими иглами или
горячим пинцетом помещают на него объект (количество объекта в одной
ванночке зависит от его размера). Осторожно наливают парафин до краев
ванночки. После того как парафин застынет, ванночку помещают в кристаллизатор с холодной водопроводной водой, оставляют на 10–15 мин.
Достают ванночку из воды и аккуратно лезвием бритвы вынимают из нее
парафиновый «пряник». Нагревают над пламенем спиртовки лезвие скальпеля и вырезают им из «пряника» кубик с объектом. Припаивают парафиновый кубик к деревянной подставке. Для этого на деревянный блок
наносят несколько капель расплавленного парафина, дают им остыть. Затем
на деревянный блок помещают раскаленное лезвие скальпеля, а на него
парафиновый кубик. Слегка надавливают пальцем на парафиновый кубик
и вынимают лезвие. Горячим скальпелем осторожно оплавляют стороны
парафинового кубика. После того как парафин остынет, лезвием бритвы
делают его грани строго параллельными друг другу.
7.2. Техника резки на микротоме
Закрепляют деревянную подставку с наклеенным на него парафиновым кубиком на столике микротома, устанавливают нужную толщину среза
и приступают к резке. При правильной резке каждый последующий срез
передним краем примыкает к заднему краю предыдущего среза, образуя
ленту. Возможные причины неудач резки на микротоме и пути их устранения приведены в табл. 4.
Полученную ленту срезов с помощью препаровальной иглы или кисточки переносят на лист черной бумаги. Скальпелем нарезают ленту на отрезки
с одинаковым количеством срезов. Размер отрезка должен соответствовать
размеру покровного стекла.
На обезжиренное сухое предметное стекло наносят каплю смеси альбумина с глицерином. Мизинец правой руки протирают 70% этиловым
спиртом и тщательно растирают им каплю альбумина на предметном стекле до появления хрустящего звука. На середину стекла пипеткой наносят
небольшое количество дистиллированной воды. Отрезки ленты располагают
в средней части предметного стекла слева направо вертикальными рядами.
Фильтровальной бумагой удаляют лишнюю воду и помещают стекло на парафиновый столик, где срезы расправляются и приклеиваются. Оставляют
на несколько дней.
Белок куриного яйца взбивают в пену и отставляют на несколько минут. Прозрачную жидкость сливают и смешивают с равным количеством чистого глицерина.
Смесь фильтруют через складчатый фильтр. В профильтрованный белок помещают
кристаллик тимола, который способствует более длительному хранению смеси. Смесь
хранят в холодильнике.
Смесь альбумина с глицерином
52
Таблица 4
Причины неудач резки на микротоме и пути их устранения
Характер неудач Причина неудач Способ устранения
Нет ленты срезов,
срезы отдельные
и сворачиваются
Объект или часть его
выпадает из среза
Лента не прямая,
а загибается в ту
или иную сторону
Срезы гофрированные
Нож скачет через
объект, выкрашивая
переднюю грань
Пробелы в срезах Нож недостаточно
Слишком твердый
парафин
Плохое пропитывание парафином, реже
плохая заливка
Неправильное сечение блока
Плохая заливка Повторить процедуру приготовления парафи-
Неправильное положение ножа
острый
Повысить температуру рабочей комнаты.
Около микротома поставить плитку, спиртовку или настольную лампу, направив ее свет
на столик микротома. Если это не помогает – повторить процедуру приготовления
парафинового блока
Поместить материал в ксилол и повторить
процедуру заливки или процедуру приготовления парафинового блока
Сделать грани куба параллельными
нового блока
Изменить положение ножа, приподняв пе-
редний край
Наточить нож или немного сместить положение ножа. Увеличить толщину среза
7.3. Техника окраски и бальзамирования срезов
Перед окрашиванием приготавливают «батарею» химических стаканов,
которые на 2/3 объема заполняют соответствующими растворами. На каждом сосуде обязательно должна быть этикетка с указанием его содержимого. Стаканы располагают на лабораторном столе в той последовательности,
в которой они будут использоваться.
Стекло со срезами нагревают с тыльной стороны над пламенем спиртовки так, чтобы парафин слегка расплавился. Несколько раз ополаскивают
стекло в стакане с ксилолом. Каждые два подготовленные таким образом
стекла соединяют тыльными сторонами и размещают их по периферии стакана. Затем стекла попарно переносят из одного стакана в другой, в соответствии с указанной в методиках последовательностью.
Существуют разнообразные методы окраски срезов. В некоторых
из них используется только один краситель, в других срезы последовательно
красятся разными красителями (Камелина и др., 1992).
Окраска срезов ацетокармином
1. Ксилол 1 – 15–30 мин.
2. Ксилол 2 – 15–30 мин.
3. Обмыть спиртом.
4. Спирт 96% (1) – 15 мин.
5. Спирт 96% (2) – 15 мин.
6. Дистиллированная вода – два
раза по 30 мин.
7. Квасцы железоаммонийные
2% – обмыть.
8. Ацетокармин – 30 мин.
53
9. Обмыть спиртом.
10. Спирт 96% (1) – 10–15 мин.
11. Спирт 96% (2) – 10 мин.
12. Обмыть ксилолом.
13. Ксилол 1 – 10 мин.
14. Ксилол 2 – 10 мин.
сят на место срезов каплю
канадского бальзама. Закрывают покровным стеклом
и оставляют на несколько
дней в термостате при температуре 50°С для подсыхания.
15. Предметное стекло вынимают из ксилола и сразу нано-
Тройная окраска
(реактив Шиффа, алциановый синий, гематоксилин по Эрлиху)
1. Ксилол 1 – 15 мин.
2. Ксилол 2 – 15 мин.
3. Ксилол 3 – 15 мин.
4. Спирт 96% (1) – 15 мин.
5. Спирт 96% (2) – 15 мин.
6. Спирт 96% (3) – 15 мин.
7. 1N НСl – 5 мин.
8. 5N НСl – 5 мин.
9. 1N НСl – 5 мин.
10. Реактив Шиффа – от 2
до 12 ч.
11. Сернистые воды – три раза
по 5 мин.
12. Проточная водопроводная вода – 2 ч.
13. Уксусная кислота 3% –
5 мин.
14. Алциановый синий – 10–
20 мин.
15. Уксусная кислота 3% –
5 мин.
16. Дистиллированная вода – два
раза по 10 мин.
17. Гематоксилин по Эрлиху –
2–15 мин.
18. Проточная водопроводная вода – 20 мин (до полного проявления темно-фиолетового
тона).
19. Дистиллированная вода –
5 мин.
20. Спирт 96% (1) – 15 мин.
21. Спирт 96% (2) – 15 мин.
22. Обмыть ксилолом.
23. Ксилол 1 – 15 мин.
24. Ксилол 2 – 15 мин.
25. Ксилол 3 – 15 мин.
26. Бальзам.
Окраска гематоксилином по Гейденгайну
Данный метод относится к регрессивным способам окрашивания. Для
удаления лишней краски препараты дифференцируют в 2% растворе железоаммонийных квасцов. Процедуру дифференциации проводят следующим
образом. Наливают небольшое количество раствора квасцов в чашку Петри,
помещают в нее предметное стекло окрашенными срезами вверх. Устанавливают чашку Петри на столик микроскопа и контролируют процесс обесцвечивания срезов при малом увеличении. Когда окраска станет оптимальной,
стекло переносят в стакан с водопроводной водой.
54
1. Ксилол 1 – 15–30 мин.
2. Ксилол 2 – 15–30 мин.
3. Обмыть спиртом.
4. Спирт 96% (1) – 15 мин.
5. Спирт 96% (2) – 15 мин.
6. Дистиллированная вода – два
раза по 30 мин.
7. Квасцы железоаммонийные
4% – 4–12 ч при комнатной
температуре или 40–60 мин
при температуре 50–60°С.
8. Гематоксилин по Гейденгайну – от 30 мин до нескольких
часов.
9. Проточная водопроводная вода – 20 мин.
Окраска гематоксилином по Деляфильду
1. Ксилол 1 –15–30 мин.
2. Ксилол 2–15–30 мин.
3. Обмыть спиртом.
4. Спирт 96% (1) – 15 мин.
5. Спирт 96% (2) – 15 мин.
6. Дистиллированная вода – два
раза по 30 мин.
7. Гематоксилин по Деляфильду – 10 мин.
10. Дистиллированная вода – два
раза по 5 мин.
11. Дифференцировка в 2% растворе железоаммонийных
квасцов.
12. Проточная водопроводная вода – 30–60 мин.
13. Обмыть спиртом.
14. Спирт 96% (1) – 10–15 мин.
15. Спирт 96% (2) – 10 мин.
16. Обмыть ксилолом.
17. Ксилол 1 – 10 мин.
18. Ксилол 2 – 10 мин.
19. Бальзам.
8. Проточная водопроводная вода – 10 мин.
9. Обмыть спиртом.
10. Спирт 96% (1) – 10–15 мин.
11. Спирт 96% (2) – 10 мин.
12. Обмыть ксилолом.
13. Ксилол 1–10 мин.
14. Ксилол 2–10 мин.
15. Бальзам.
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК
Александров В. Я. Упрощенный способ инфильтрации растительных тканей //
Ботанический журнал. 1954. Т. 39. С. 421–422.
Еналеева Н. Х., Тырнов В. С., Хохлов С. С. Выделение зародышевых мешков
покрытосеменных растений путем ферментативной мацерации тканей // Цитология
и тенетика. 1972. Т. 6, № 5. С. 439–441.
Камелина О. П., Проскурина О. Б., Жинкина Н. А. К методике окраски эмбриологических препаратов // Ботанический журнал. 1992. Т. 77, № 4. С. 93–96.
Куприянов П. Г. Ускоренные методы исследования зародышевого мешка //
Выявление апомиктичных форм во флоре цветковых растений СССР. Саратов :
Издательство Саратовского университета, 1978. С. 155–163.
Куприянов П. Г. Диагностика систем семенного размножения в популяциях
цветковых растений. Саратов : Издательство Саратовского университета, 1989. 159 с.
Орлова И. Н., Авалкина Н. А. Приготовление препаратов целых зародышевых
мешков пшеницы, ржи и тритикале: метод. указания. Л. : Издательство ВИР, 1985.
18 с.
Семенова Е. В. Просветление семяпочек и вычленение зародышевых мешков
кормовых бобов с целью определения их фертильности. Л. : Издательство ВИР,
1988. 20 с.
Юдакова О. И. Методы цитоэмбриологического анализа. Саратов : Издательство
Саратовского университета, 1999. 20 с.
Юдакова О. И., Гуторова О. В., Беляченко Ю. А. Методы исследования репродуктивных структур и органов растений. Саратов : Издательство Саратовского
университета, 2012. 38 с.
Herr Jm. J. M. A new clearing-squash technique for study of ovule, development
in angiosperms // Amer. J. Bot. 1971. Vol. 20, № 8. P. 785–790.
СПИСОК РЕКОМЕНДУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
Барыкин, Р. П. Справочник по ботанической микротехнике. Основы и методы /
Р. П. Барыкин, Т. Д. Веселова, А. Г. Девятов, Х. Х. Джалилова, Г. М. Ильина,
Н. В. Чубатова. М. : Издательство МГУ, 2004. 312 с.
Бородин, В. О.
ских науках / В. О. Бородин, Д. Х. Сабиров, А. Н. Цыбина, Е. А. Звада // Научное
обозрение. Педагогические науки. 2019. № 5, ч. 2. С. 36–40.
Бумагина, С. И. Цитогенетика. Методические указания к практическим занятиям / С. И. Бумагина. Махачкала, : ИПЦ ДГУ, 1982. 28 с.
Главацкая, Т. П. Методические указания к практической части курса «Цитология и эмбриология растений» / Т. П. Главацкая. Свердловск : Издательство
Уральского университета, 1980. 34 с.
Микроскопические методы и их роль в современных биологиче-
56
Мурадов, С. В. Лабораторный практикум по дисциплине «Микротехника»: учеб.-
метод. пособие / С. В. Мурадов, Е. А. Девятова, Т. П. Головина. Чебоксары : ИД
«Среда», 2019. 84 с.
Определение числа хромосом и описание их морфологии в меристеме и пыльцевых зернах культурных растений: метод. указания / под ред. Л. И. Орел. Л. :
Наука. Ленингр. отд-ние, 1988. 60 с.
Паламарчук, И. А. Большой практикум по высшим растениям / И. А. Паламарчук. М. : Издательство МГУ, 1964. 72 с.
Паушева, З. П. Практикум, по цитологии растений / З. П. Паушева. М. : ВО
«Агропромиздат», 1988. 271 с.
Рыбин, В. А. Применение цитологического метода при селекционной работе с
плодовыми / В. А. Рыбин. Кишинев : ШТИИНЦА, 1962. 168 с.
Самигуллина Н. С. Практикум по генетике: учеб. пособие / Н. С. Самигуллина,
И. Б. Кирина. Мичуринск : Издательство МичГАУ, 2007. 211 с.
Содержание
Предисловие . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3
1. Микроскопический анализ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4
1.1. Краткая история развития микроскопии . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4
1.2. Классификация микроскопов . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8
1.3. Устройство светового микроскопа . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13
1.4. Правила работы со световым микроскопом . . . . . . . . . . . . . . . . . 15
2. Методы приготовления препаратов живых растительных объектов . . . 18
2.1. Кратковременные прижизненные наблюдения растительных клеток . . 18
2.2. Микроскопирование живых объектов в течение продолжительного
времени . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22
3. Методы приготовления тотальных препаратов растительных клеток . . 24
3.1. Сбор и фиксация материала . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24
3.2. Окраска материала . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27
3.3. Сроки хранения препаратов . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30
3.4. Перевод временных препаратов в постоянные . . . . . . . . . . . . . . . 31
4. Методы приготовления тотальных препаратов для изучения особенно-
стей деления клеток, плоидности и кариотипа растений . . . . . . . . . . . . 33
4.1. Методика приготовления давленных препаратов клеток меристемы
корня, окрашенных ацетокармином
4.2. Методика приготовления давленных препаратов клеток меристемы
корня, окрашенных ацетогематоксилином . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34
4.3. Методика приготовления давленных препаратов клеток меристемы
стебля, окрашенных ацетокармином . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35
5. Ускоренные методы анализа мужской генеративной сферы растений . 35
5.1. Методика приготовления давленных препаратов пыльников, окрашен-
ных ацетокармином . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36
5.2. Методика приготовления давленных препаратов пыльников, окрашен-
ных ацетогематоксилином . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36
5.3. Методика приготовления временных ацетокарминовых препаратов
зрелой пыльцы . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37
5.4. Методика приготовления глицерин-желатиновых препаратов зрелой
пыльцы, окрашенной ацетокармином . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38
5.5. Анализ качества пыльцы . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38
5.6. Методы изучения роста пыльцевых трубок в тканях пестика . . . . . . 40
6. Ускоренные методы анализа женской генеративной сферы растений . . 41
6.1. Методика выделения целых зародышевых мешков с помощью ферментативной мацерации и последующей диссекции семязачатков . . . 41
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33
58
6.2. Методика выделения целых зародышевых мешков из мацерированных
соляной кислотой семязачатков . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44
6.3. Методика выделения целых зародышевых мешков с помощью ферментативной мацерации семязачатков и последующего центрифуги-
рования . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45
6.4. Методика приготовления препаратов семязачатков посредством про-
светления тканей . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46
7. Методы приготовления постоянных микротомных препаратов . . . . . . 50
7.1. Заливка материала в парафин . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50
7.2. Техника резки на микротоме . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52
7.3. Техника окраски и бальзамирования срезов . . . . . . . . . . . . . . . . . 53
Библиографический список . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 56
Список рекомендуемой литературы . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 56
Учебное издание
Юдакова Ольга Ивановна
М Е Т О Д Ы
МИКРОСКОПИЧЕСКОГО АНАЛИЗА
В БОТАНИКЕ
Учебно-методическое пособие
для студентов биологического факультета,
обучающихся по направлению подготовки бакалавриата
06.03.01 Биология
Редактор Е. А. Митенёва
Технический редактор С. С. Дударева
Корректор Е. А. Митенёва
Оригинал-макет подготовил И. А. Каргин
Подписано к использованию
Усл. печ. л. 3.49 (3.75). Объем данных 1,5 Мб.
Издательство Саратовского университета.
410012, Саратов, Астраханская, 83.
30.10.2023
. Формат
60 × 841/16.